液相色谱-串联质谱法测定饲料中16 种氨基酸

贺习文，雷 浩，高勤叶，赵雪宁，温 卉，马 川

（陕西秦云农产品检验检测股份有限公司，陕西渭南714000）

氨基酸是含有碱性氨基和酸性羧基的一类有机化合物，是构成生命体蛋白质的基本物质。蛋白质作为人体必需的营养物质，在人体内不能被直接利用，而是在胃肠道中经过多种消化酶的作用，将高分子蛋白质分解为低分子的氨基酸后被人体吸收[1]。氨基酸进入血液中与其输出速度几乎相等，使体内氨基酸代谢处于动态平衡。当摄入的蛋白质含量适宜时，蛋白质和氨基酸之间不断合成和分解形成一种平衡，从而达到机体的营养平衡状态。蛋白质突然增加或减少摄入量时，平衡机制会被破坏。如果持续时间过长，可能会导致体内抗体的死亡[2-3]。饲料作为畜禽动物摄入的食物，对其所含氨基酸含量的监测至关重要。

检测氨基酸的方法有氨基酸分析仪法[4-5]、毛细管电泳检测紫外测定法、衍生-电位传感法[6-7]、高效液相色谱法[8-10]等。氨基酸分析仪法最为常见，但分析时长在1 h以上、检测效率低；毛细管电泳检测紫外测定法存在精度低、检测结果不准确的缺点；高效液相色谱法检测时长较长、需要柱前衍生、操作步骤烦琐。所以，建立一种能快捷准确的测定饲料中氨基酸含量的液相色谱-串联质谱法迫在眉睫。目前，已有液相色谱-串联质谱法（LC-MS）检测食品和保健品中的氨基酸含量[11-16]。本研究建立能同时测定不同种类的饲料中16 种氨基酸的LC-MS 方法，为饲料中氨基酸含量的测定提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

UltiMate 3000 液相色谱系统（Thermo）、TSQ Quantiva质谱仪（Thermo）、MS205DU 十万分之一天平（Mettler Toledo）、101-1A电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）、MTN-5800A 氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）、涡轮混合器。

1.2 试验试剂

16种氨基酸标准溶液（100 nmol/mL）购自德国曼默博尔公司；盐酸（优级纯）购自四川西陇科学有限公司；甲酸（色谱纯）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；购自甲醇（色谱纯）Sigma公司。

6 mol/L 盐酸溶液：500 mL 盐酸和 500 mL 等比例混合；0.1%甲酸溶液：移取1.0 mL 甲酸于1 000 mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD 50×2.1 mm，1.9 μm；柱温：40 ℃；流速：0.2 mL/min；洗脱程序见表1。

表1 液相色谱洗脱程序Tab.1 Liquid chromatography elution program

1.3.2 质谱条件

离子源：可加热电喷雾离子源（H-ESI）；扫描模式：正离子扫描；喷雾电压：3 500 V；鞘气：35 psi；辅助气：10 psi；离子传输管温度：350 ℃；源温度：300 ℃；16种氨基酸质谱多反应监测（SRM）参数见表2。

1.3.3 标准工作溶液的配制

准确移取1.2 中的16 种氨基酸标准溶液1.0 mL 于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀释并定容至刻度，配制成浓度为10 μmol/L的标准工作溶液。

1.3.4 样品前处理

称取试样约100 mg，置于20 mL 水解管中，加入6 mol/L 的盐酸溶液10.0 mL，于氮气下充氮3 min，赶去管中空气，加盖；（110±2）℃的电热鼓风干燥箱中水解24 h，取出冷却，摇匀，使用快速定性滤纸过滤至另一10 mL 离心管中；量取0.1 mL样液于55 ℃下氮气吹干，按样品中氨基酸含量，加入1~10 mL 的0.1%甲酸水溶液复溶，过0.22 μm 水相滤膜后上机测定，上机溶液中各氨基酸含量应与标准工作溶液相近。

2 结果与分析

2.1 前处理过程的确定

根据GB/T 18246—2019中的前处理过程，对部分操作进行适当优化，经过试验验证，水解管不需在冷冻环境下进行充氮操作，只需用氮气赶尽管中的空气，因此直接将水解管置于氮气下充氮3 min 即可；水解后分取的样液仅为0.1 mL，可直接在氮气下吹干，对实验室内环境不会造成太大污染，样液在氮气下吹干后，使用适合质谱仪的0.1%甲酸水溶液进行复溶，能够减小溶剂效应对试验结果的干扰。

2.2 16种氨基酸的线性方程和检出限（见表3）

将1.2 中的16 种氨基酸标准溶液稀释成浓度在0.01~50.00 μmol/L 的标准系列溶液，上机进行测定，以标准溶液浓度作为横坐标x（μmol/L），以峰面积作为纵坐标y建立标准曲线。由表3 可知，16 种氨基酸在0.01~50.00 μmol/L 范围内线性良好，相关系数均大于0.990 0。

以3倍的性噪比（S/N）所对应的质量作为检出限，结果显示16种氨基酸所能达到的检测低限为1~10 ng/g。

表3 16种氨基酸的线性方程和检出限Tab.3 Linear equations and detection limits of 16 amino acids

2.3 16种氨基酸的重复性测试（见表4）

称取同一样品共6 份，按照1.3.4 前处理方法制备样液，在试验条件下进行测定，以出峰时间计算定性重复性，以氨基酸含量计算定量重复性。由表4可知，16种氨基酸的定性重复性在0.02%~0.12% 之间，定量重复性在0.11%~0.94%之间，表明方法具有较好的精密度。

2.4 16种氨基酸的回收率测试（见表5）

选用采购自美正公司的鱼粉质控样品，样品中16种氨基酸的量值及其扩展不确定度均为已知，按前处理过程处理试样，上机测定后计算回收率。由表5 可知，16 种氨基酸的回收率在97.3%~104.0%之间，实测结果与质控样标示量值的相对偏差均在2.0%以下，表明方法回收率良好。

2.5 实际样品测定结果

选用配合饲料、浓缩饲料、鱼粉、肉粉等不同种类的样品共8 份，采用GB/T 18246—2019 与本方法同时对8 份样品中16种氨基酸进行测定，结果表明，16种氨基酸的相对偏差均在5%以内，证明本方法测得结果准确可靠。

表4 16种氨基酸的重复性测试（n=6）Tab.4 Repeatability test of 16 amino acids(n=6) 单位：%

表5 16种氨基酸的回收率测试Tab.5 Recovery rate test of 16 amino acids 单位：%

3 结论

研究基于液相色谱-串联质谱仪定性准确、检测效率高等特点，通过优化样品前处理过程和液相色谱-质谱条件，建立能够同时测定饲料中16种氨基酸的检测方法。本方法处理过程简单、易操作，经试验证实检出限低、灵敏度高、精密度良好、回收率、准确度高。与检测用时较长的氨基酸分析仪相比，能够缩短分析时间、提高检测效率。研究为饲料中16种常规氨基酸含量的检测提供参考。