酶解猪血制备氨基酸液体肥工艺条件优化

2021-07-02蔡艺菲赵鑫阳田晓静丁功涛陈士恩

现代畜牧兽医 2021年6期

蔡艺菲，赵鑫阳，田晓静，2*，宋礼，罗丽，丁功涛，2，曹竑，2，陈士恩，2

（1. 西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730124；2. 西北民族大学生物医学研究中心中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃兰州730030；3. 甘南牦牛乳研究院，甘肃甘南747000）

我国年出栏生猪约7 亿头，屠宰生猪产生的副产物猪血约有200万t[1]。猪血中含有大量的蛋白质和丰富的氨基酸，包括人体所必需的8 种氨基酸在内的18 种氨基酸，特别是赖氨酸、亮氨酸含量丰富[2]。猪血除少量直接食用外，其余猪血资源的利用率很低。血液排放后，极易腐烂变质，滋生大量微生物，导致水源污染和农田土质恶化等问题。用酶解法对猪血红蛋白进行处理，可以有效提高血蛋白的利用率[3]。研究表明，可以利用酶解猪血血红蛋白制备血红素、螯合肽、抗氧化肽、氨基酸液体肥等[4-8]。液体肥料又称流体肥料，是含有一种或多种农作物生长必需营养元素的液体肥。氨基酸是其主要成分之一。氨基酸液体肥生产成本低、高效、无污染。因此，研究猪血血红蛋白的水解可以有效利用猪血，获得巨大的经济效益，同时缓解废弃血液带来的环境污染。目前，国内对利用酶解法水解猪血蛋白制备氨基酸液体肥的研究较少。因此，为了获得更高效的水解工艺，本研究利用风味蛋白酶水解猪血中的蛋白，优化氨基酸液体肥的制备工艺的条件，研究较佳水解猪血蛋白的参数，为利用猪血生产氨基酸液体肥加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料与试剂：干燥猪血粉、风味蛋白酶、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、氢氧化钠、对硝基苯酚、乙酸钠、无水乙酸钠、乙酸、37%甲醛、乙酰丙酮、酚酞、乙醇、邻苯二甲酸氢钾基准物质。

仪器：SL-1001电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）、HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）、PHS-3C pH计（上海雷磁有限公司）、L3S可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）、恒温干燥箱（日本日立公司）、722E型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

新鲜猪血抗凝处理，真空冷冻干燥制成猪血粉。

1.2.2 总氮的测定

参照GB 5009.5—2016，采用分光光度计法测定总氮（Nt）的含量。采用分光光度计法测定总蛋白（TP）含量。

1.2.3 氨基态氮测定

参照GB 5009.235—2016中酸度计法测定氨基态氮（N0）。

1.2.4 水解率测定

用甲醛滴定法测氨基态氮含量，按下式计算水解率（DH）。

1.2.5 单因素试验

以水解率为指标，通过单因素试验研究料液比（1∶6、1∶7.5、1∶9、1∶10.5、1∶12 g/mL）、酶添加量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g 蛋白）、pH 值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、温度(40、45、50、55、60 ℃）和水解时间(2、3、4、5、6 h)对血液水解率的影响。

1.2.6 正交试验

在单因素试验基础上，采用5 因素3 水平正交试验优化提取工艺，正交试验因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factor level table of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对血液水解率的影响（见图1）

图1 料液比对血液水解率的影响Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on blood hydrolysis rate

猪血红蛋白的水解率起初随着底物质量浓度的增加而增加，之后水解率随底物质量浓度的增加有所降低，即此时酶与底物结合达到饱和，底物质量浓度的增加不再提高反应效率，反而因底物浓度过大，降低酶在溶液中的扩散能力；另一方面，过量底物可能通过分子间作用力与酶结合形成中间产物，抑制酶解反应的进行，使得水解率降低[9]。在 pH 值7、酶浓度 8 000 U/g、温度50 ℃、时间 4 h 的条件下，研究血液水解率随料液比（1∶6.0、1∶7.5、1∶9.0、1∶10.5、1∶12.0 g/mL）的变化规律。由图1 可知，料液比在1∶6.0~1∶7.5 g/mL 范围内，血液水解率随料液比的减小而减小。料液比在1∶7.5~1∶9.0 g/mL 范围内，血液水解率随料液比的减小而提高。料液比在1∶9.0~1∶10.5 g/mL 范围内，血液水解率随料液比的减小而降低。料液比在1∶10.5~1∶12.0 g/mL 范围内，血液水解率随料液比的减小而增大。在料液比为1∶9.0 g/mL 时，血液水解率最高。因此，选择料液比为1∶9.0 g/mL作为较佳的料液比。

2.1.2 酶添加量对血液水解率的影响（见图2）

蛋白酶促进蛋白的降解本质是酶结合部位与蛋白质的特定氨基酸残基结合后，酶催化部位降低蛋白水解发生的活化能，会有酶的饱和与底物饱和的状态。当底物的量过大，酶结合部位达到饱和，底物浓度增大不会增加水解的发生。当底物浓度过饱和时，酶量的增加不会增加水解的发生，随酶量的增加水解率效果与成本不成正比[10]。在料液比1∶9.0 g/mL、pH值7、温度50 ℃、时间4 h的条件下，研究血液水解率随酶添加量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g 蛋白）的变化规律。由图2 可知，酶添加量在4 000~10 000 U/g 蛋白范围内，血液水解率随酶添加量的增加而提高。酶添加量在10 000~12 000 U/g蛋白范围内，血液水解率随酶添加量的增加而降低。在酶添加量10 000 U/g蛋白时，血液水解率最高。因此，选用酶添加量为10 000 U/g蛋白作为较佳的酶添加量。

图2 酶添加量对血液水解率的影响Fig.2 Effect of enzyme addition on blood hydrolysis rate

2.1.3 pH值对血液水解率的影响（见图3）

蛋白酶只有在一定pH值范围下才能达到较高的水解率，pH值偏低或偏高都会对水解效果产生较大的影响。过酸或过碱都会使蛋白酶逐渐变性失活，影响酶解效果[11]。在料液比 1∶9 g/mL、温度 50 ℃、时间 4 h、酶添加量1 000 U/g 蛋白的条件下，研究血液水解率随pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的变化规律。由图3可知，pH值在6.0~6.5范围内，血液水解率随pH 值的增大而提高。pH 值在6.5~8.0 范围内，血液水解率随pH 值的增大而降低。在pH值为6.5时，血液水解率最高。因此，选用pH值为6.5时作为较佳的pH值。

图3 pH值对血液水解率的影响Fig.3 Effect of pH on enzymatic hydrolysis

2.1.4 时间对血液水解率的影响（见图4）

在水解前期蛋白酶的活力比较高，与底物结合水解率较大。随着水解时间的延长，蛋白酶的活力下降，水解率也难以提高。在料液比1∶9 g/mL，温度50 ℃，pH值6.5，酶添加量1 000 U/g蛋白的条件下，研究血液水解率随水解时间（2、3、4、5、6 h)的变化规律。由图4可知，时间在2~6 h范围内，血液水解率随时间的增加而提高。在2~5 h 范围内水解率上升趋势较明显。在5~6 h 内，水解率上升趋势较小，此时间范围内水解率变化较小。考虑节省时间成本和其他消耗成本，选用水解时间为5 h 作为较佳的水解时间。

图4 时间对血液水解率的影响Fig.4 Effect of time on blood hydrolysis rate

2.1.5 温度对血液水解率的影响（见图5）

在蛋白酶的适宜温度范围内有助于酶解反应的进行，这是因为酶的作用速度随温度升高而加速，但温度升高到一定限度后，酶的活性就要钝化，直至完全失活。在料液比1∶9.0 g/mL、时间5 h、pH值6.5、酶添加量1 000 U/g蛋白的条件下，研究血液水解率随水解温度（40、45、50、55、60 ℃）的变化规律。由图5可知，温度在40~50 ℃范围内，血液水解率随水解温度的增大而提高。温度在50~60 ℃范围内，血液水解率随水解温度的升高而降低。在水解温度为50 ℃时，水解率最高。因此，选用水解温度为50 ℃时作为较佳的水解温度。

图5 温度对血液水解率的影响Fig.5 Effect of temperature on blood hydrolysis rate

2.2 正交试验结果

本研究以pH 值、酶添加量、料液比、温度、时间为因素，以水解率为指标，采用5因素3水平正交试验优化。正交试验设计及结果见表2。由表2可知，极差分析的结果表明，各因素影响顺序依次为A>C>E>D>B，即pH 值对血红蛋白酶水解产生主要作用，其次是料液比、时间、酶添加量和温度。较佳提取参数为A₁B₂C₃D₃E₃，即得到水解较佳条件为料液比1∶10.5 g/mL、pH 值6、水解温度50 ℃、酶浓度12 000 U/g 蛋白、水解时间7 h，此时水解率为40.42%。由于酶种类不同，此试验各项结果均高于其他文献，同时水解率也略高。