白杨素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌Bax和Bcl-2表达的影响

罗斌 田芳芳 田俊斌 吕俊林 马磊 吕建瑞

摘要 目的：研究白楊素对心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）大鼠的作用，同时观察其对心肌凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响。方法：SPF级SD大鼠60只适应性喂养2周后，按体质量大小依次分为假手术组、模型组、阳性药物雷米普利组、白杨素低、中和高剂量组，每组10例，疗程2周，后采用可逆左冠状动脉前降支结扎法建立MI/RI模型，假手术组只穿线但不结扎。手术后收集血液检测血清肌酸激酶同功酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、白细胞介素（Interleukin，IL）-6、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，TTC法评估心肌梗死面积，HE染色观察心肌病理学，Western Blot检测心肌Bax和Bcl-2蛋白表达特点。结果：与假手术组比较，模型组心肌梗死面积明显增加（P<0.05），心肌纤维断裂，与模型组比较，白杨素3个剂量组和雷米普利组心肌梗死面积降低（P<0.05），心肌细胞形态改善;与假手术组比较，模型组血清CK-MB、LDH、IL-6和MDA增加（P<0.05），SOD降低（P<0.05），与模型组比较，白杨素3个剂量组和雷米普利组CK-MB、LDH、IL-6和MDA降低（P<0.05），SOD升高（P<0.05）;与假手术组比较，模型组心肌Bax蛋白表达明显增加（P<0.05），Bcl-2表达降低（P<0.05），与模型组比较，白杨素3个剂量组和雷米普利组Bax蛋白表达降低（P<0.05），Bcl-2上调（P<0.05）。结论：白杨素对MI/RI大鼠血清心肌酶CK-MB和LDH，炎性因子IL-6，氧化和抗氧化指标MDA和SOD均有调节作用，同时可降低心肌梗死面积，其作用机制可能与白杨素能够调节Bcl-2和Bax蛋白表达有关。

关键词 白杨素;大鼠;心肌缺血再灌注;心肌细胞;凋亡

Effect of Chrysin on Bax and Bcl-2 in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Luo Bin1，Tian Fangfang2，Tian Junbin1，LYU Junlin1，MA Lei1，LYU Jianrui1

（1 The Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710004，China; 2 Department of Anesthesiology，Tangdu Hospital，Second Affiliated Air Force Military Medical University，Xi′an 710038，China）

Abstract Objective：To study the therapeutic effects of chrysin on MI/RI rats，and to observe the proteins expression of Bax and Bcl-2.Methods：According to weight，A total of 60 SD rats after adaptive feeding for 2 weeks were divided into a sham operation group，a model group，a positive drug ramipril group，chrysin low，medium and high dose groups，n=10.The course of treatment was 2 weeks.Later，the MI/RI model was established by reversible left anterior descending coronary artery ligation.The sham operation group only threaded but not ligated.Later，the MI/RI model was established by reversible left anterior descending coronary artery ligation.The sham operation group only threaded but not ligated.After the operation，blood was collected for serum creatine kinase isoenzyme（CK-MB），lactate dehydrogenase（LDH），interleukin（IL）-6，superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）content.TTC method was used to evaluate myocardial infarction area，HE staining was used to observe myocardial pathology.Western Blot was used to detect myocardial Bax and Bcl-2 protein expression characteristics.Results：Compared with the sham group，the infarct size in the model group was increased（P<0.05），the myocardial fibers were broken，compared with the model group，the myocardial infarct size was improved in the 3 dose groups of Chrysin and Ramipril group（P<0.05）.Cardiomyocyte morphology improved; compared with the sham group，serum CK-MB，LDH，IL-6 and MDA increased in the model group（P<0.05），SOD decreased（P<0.05）.com

pared with the model group，CK-MB，LDH，IL-6 and MDA in the 3 doses of chrysin and ramipril group decreased（P<0.05），and SOD decreased（P<0.05）; Compared with the sham operation group，the expression of Bax protein in the myocardium of the model group was significantly increased（P<0.05），and the expression of Bcl-2 was decreased（P<0.05）.com

pared with the model group，the three-dose group of chrysin and expression Bax protein in Puri group was reduced（P<0.05），and Bcl-2 was up-regulated（P<0.05）.Conclusion：Chrysin has a regulatory effect on serum myocardial enzymes CK-MB and LDH，inflammatory factor IL-6，oxidation and antioxidant indicators MDA and SOD in MI/RI rats，and can reduce the area of myocardial infarction.Its mechanism of action may be related to that of chrysin regulating Bcl-2 and Bax protein expression.

Keywords Chrysin; Rat; Myocardial ischemia-reperfusion injury（MI/RI）; Cardiomyocyte; Apoptosis

中图分类号：R242;R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.014

心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia-reperfusion Injury，MI/RI）是冠心病死亡的主要原因，患者突发急性心肌梗死后，可诱发心肌细胞大量死亡，进而诱发心肌细胞增生、凋亡以及胶原疤痕等一系列病理反应[1]。一般而言，在早期心肌重塑过程中心脏有一定能力能够维持自身结构完整和心功能正常，但患者發生持续性心肌梗死后会导致心肌结构改变和心功能异常，这也是导致患者死亡的根本因素[2-3]。目前在临床中并没有特效药物可抑制或逆转心肌结构重塑，因此延缓心肌重塑是当前研究热点[4]。白杨素是黄酮类化合物的一种，其在蜂胶中含量较高，近年来研究发现，白杨素具有多种药理活性，具有抗病毒、杀菌、抗癌、消炎等多种功效[5-6]，关于其对心肌保护也有研究报道，如肖慧玉等[7]采用白杨素治疗机械性创伤（MT）继发性心肌损伤大鼠，结果发现白杨素对其具有明显的保护作用，此外还有研究观察了白杨素对早期糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用[8]。但在总结文献时发现，目前的研究还没有白杨素对MI/RI的相关研究报道，为此本研究采用经典造模法成功复制MI/RI大鼠模型，从细胞凋亡途径蛋白Bax和Bcl-2观察其对心肌细胞是否有保护作用，以为MI/RI的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性健康SPF级SD大鼠60只，体质量180～220 g，由第四军医大学动物实验中心提供（合格证号：SCXK（陕）2014-002），大鼠在购买后饲养于西安交通大学医学院，饲养条件为每笼10只，温度21～26 ℃，湿度40%～60%，每天照明时间12 h。大鼠均有专业人员负责饲养，日常自由进食和饮水。

1.1.2 药物 白杨素（上海纯优生物科技有限公司，批号：180724），雷米普利（昆山龙灯瑞迪制药有限公司，批号：180716）。

1.1.3 试剂与仪器 血清肌酸激酶同功酶（Creatine Kinase Isoenzymes，CK-MB）、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）和白细胞介素（Interleukin，IL）-6试剂盒（武汉博士德生物科技公司，货号：CSB-E14403r，CSB-E11324r，CSB-E04640r），超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成生工工程研究所，货号：A001-3-2，A003-1-2），Bcl-2、Bax和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH）抗体（Abcam公司，美国，货号：EPR17509，E63，6C5），偏氟乙烯[Poly（Vinylidene Fluoride），PVDF]（迈博瑞生物膜技术有限公司，货号：IPVH00010），总蛋白提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：BC3711），BCA蛋白定量试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：C503021）。

高速冷冻离心机（湖南迈克尔实验仪器有限公司，型号：DL-6MB型），酶标仪（海酶联生物科技有限公司，型号：ML-dr3518G型），分光光度计（冠森生物科技上海公司，型号：723型），切片机（徕卡生物，德国，型号：RM2235型），超低温冰箱（青岛海尔，型号：DW-86L388型），蛋白电泳系统（伯乐公司，美国，型号：Y.Mini-PROTEAN Tetra型）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 所有大鼠在适应性喂养2周后按照体质量大小依次分组，分为假手术组、模型组、阳性药物雷米普利组、白杨素低剂量观察组、白杨素中剂量观察组和白杨素高剂量组，每组10只。

心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia-reperfusion Injury，MI/RI）模型构建参照文献[9]进行，采用戊巴比妥钠麻醉后将其固定于解剖版，连接呼吸机，设定呼吸频率为80次/min、潮气量为15 mL/kg、呼吸比为1∶1，碘伏消毒后找到左侧胸壁第3～4肋骨，切开后暴露心脏，剥离心包膜后于左心耳下缘2～3 mm处结扎，后进行常规缺血再灌注损伤手术，假手术组只给予穿线但不结扎。造模成功的标志为心尖颜色发白，同时心电图有明显ST段抬高。

1.2.2 给药方法 假手术组给予1.0 mL/kg生理盐水胃治疗，模型组给予1.0 mL/kg生理盐水胃治疗，阳性药物雷米普利组给予1.0 mg/kg雷米普利灌胃治疗，白杨素低剂量观察组给予10 mg/kg白杨素灌胃治疗，白杨素中剂量观察组给予20 mg/kg白杨素灌胃治疗，白杨素高剂量组给予40 mg/kg白杨素灌胃治疗，连续给药2周后进行后续实验。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 标本采集 腹主动脉取血法收集大鼠血液（约2 mL左右），血液取出后4 000 r/min离心，离心半径4 cm，10 min后提取血清，血清收集后置入-20 ℃冰箱中保存备用。取出心脏组织，将其横切成3部分，其中一部分置于超低温冰箱中保存备用，一部分至于组织固定液中用于相关病理学的检测，另一部分用于测定心肌梗死面积。

1.2.3.2 心肌梗死面积的测定 将心肌组织冻干后切成1 mm左右的薄片，置入1%的TTC溶液中，37 ℃条件下避光孵育15 min，后比较分析梗死面积（正常区为红色，梗死区为灰白色）。梗死面积为梗死区总面积/缺血区总面积×100%。

1.2.3.3 生化指标的测定 采用酶标仪测定血清CK-MB、CK-MB、IL-6和SOD，采用分光光度计测定MDA，测定时按照试剂盒提供的说明书进行。

1.2.3.4 形态学观察 从组织固定液中取出心肌组织，将其按照文献[10]报道，自来水过夜冲洗后常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色，后采用带有照相功能的光学显微镜采集图像即可。

1.2.3.5 蛋白表达的检测 取出肝脏组织，按照试剂盒提供的说明书提取总蛋白，蛋白提取后BCA法对其定量并调平，然后每组各取50 μg行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后转移至甲醇活化后的PVDF膜，后依次经5%的脱脂牛奶封闭、一抗过夜孵育（Bcl-2抗体浓度为1∶3 000、Bax为1∶3 000，GAPDH为1∶5 000），二抗孵育（1∶5 000）、ECL滴加后凝胶成像系统收集图像即可即可。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌组织梗死面积比较 与假手术组比较，模型组心肌梗死面积明显增加（P<0.05），与模型组比较，白杨素3个剂量组和雷米普利组心肌梗死面积明显降低（P<0.05），其中白杨素高剂量组基本和雷米普利組相一致。见图1。

2.2 CK-MB和LDH比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清中CK-MB和LDH明显升高（P<0.05），与模型组比较，白杨素3个剂量组和雷米普利组明显降低（P<0.05），此外白杨素高剂量组和雷米普利组没有差异。见表1。

2.3 血清IL-6、SOD和MDA浓度 与假手术组比较，模型组血清IL-6和MDA均明显升高（P<0.05），SOD明显降低（P<0.05），与模型组比较，白杨素3个剂量组和雷米普利组IL-6和MDA明显降低（P<0.05），SOD明显升高（P<0.05），此外白杨素3个剂量组和雷米普利组比较差异无统计学意义。见表2。

2.4 病理学结果 假手术组心肌纤维排列整齐，纤维无断裂，模型组则出现典型的心肌纤维断裂和水肿，与模型组比较，白杨素3个剂量组和雷米普利组均有明显改善。见图2。

2.5 Bcl-2与Bax蛋白表达水平 与假手术组比较，模型组心肌组织中Bax蛋白表达明显升高（P<0.05），而Bcl-2则明显降低（P<0.05），与模型组比较，白杨素3个剂量组和雷米普利组Bax均明显降低（P<0.05），Bcl-2表达明显升高（P<0.05），但白杨素3个剂量组和雷米普利组各组比较差异无统计学意义。见图3。

3 讨论

近年来通过药物干预再灌注给心肌带来的损伤是国内外研究热点[11]。本研究采用经典造模法构建MI/RI大鼠模型，研究结果发现，与假手术组比较，模型组大鼠血清CK-MB和LDH明显升高，这提示所构建的MI/RI大鼠具有明显心肌酶谱表达异常，同时心肌组织病理学可见，与假手术组比较，模型组心肌有明显心肌纤维断裂，此外，与假手术组比较，模型组心肌梗死面积增加，这提示本研究所构建的MI/RI大鼠有明显心肌损害。

杨梅素在蜂胶中含量较高，是蜂胶总黄酮的主要成分。近年来关于蜂胶总黄酮在MI/RI中有大量研究，如早在2005年，国内学者杨明等[12]研究显示蜂胶总黄酮对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，此外隋殿军等[13]也进行了相似的研究。但蜂胶总黄酮的成分较多，包括金合欢素、毛地黄黄酮、黄良姜精、兰肉桂酸、阿魏酸、白杨素、橙皮甙、槲皮素、柑桔黄素、芦丁等[14-15]，因此研究其不同成分的主要作用，对蜂胶的药理价值开发具有积极的意义，为此本次研究选取了白杨素，以观察其对MI/RI是否有调节作用，并从细胞凋亡途径研究其作用机制。

目前的研究显示，参与心肌细胞凋亡的主要基因有Bc1-2、p21、p53及caspase家族蛋白等[16-19]。本次研究重点研究Bcl-2家族基因，在Bcl-2家族基因中，Bc1-2主要功能为抑制细胞凋亡，Bax为促进细胞凋亡，二者协同作用，通过控制其含量高低以控制细胞是否凋亡[20]。本研究发现与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Bax蛋白表达升高，Bcl-2表达明显降低，白杨素和雷米普利组治疗后，Bax表达均降低，Bcl-2表达升高，这提示白杨素对MI/RI大鼠心肌细胞凋亡有明显的抑制作用。

4 结论

综上所述，本次研究结果发现，白杨素对心肌缺血再灌注损伤具有明显的治疗作用，其可以改善MI/RI大鼠心肌酶谱，降低炎性反应，提高抗氧化能力，这与其可降低Bax蛋白表达，同时升高Bcl-2蛋白表达有关。

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（2020-01-22收稿 责任编辑：徐颖）

基金项目：陕西省自然科学基础研究计划课题（2018JM7087）

作者简介：罗斌（1984.07—），男，碩士研究生，住院医师，研究方向：心脑缺血再灌注损伤与保护研究，E-mail：robinlb03@163.com

通信作者：吕建瑞（1968.12—），男，本科，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：心脑缺血再灌注损伤与保护，E-mail：ljr2011@139.com