HPLC法同时测定薄荷配方颗粒中6种成分的含量

田伟 李葆林 张闯 甄亚钦 王鑫国 牛丽颖

摘要：为了提高薄荷配方颗粒的质量标准，建立其多指标定量评价体系，采用HPLC法同时测定薄荷配方颗粒中咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷6种成分的含量。采用Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇（A）-乙腈（B）-5%冰乙酸（C）为流动相，梯度洗脱，流速为0.6 mL/min，柱温为35 ℃，咖啡酸、迷迭香酸、蒙花苷的检测波长为330 nm，橙皮苷、香蜂草苷的检测波长为284 nm，香叶木苷的检测波长为380 nm。结果表明，薄荷配方颗粒中6种待测成分的线性关系、分离度、重复性均符合要求，各成分的平均回收率分别为99.19%，98.06%，100.45%，98.90%，100.17%，99.78%。不同廠家的薄荷配方颗粒中6种化学成分的含量存在一定差异。建立的HPLC分析方法简便、快速、准确，可以为薄荷配方颗粒的质量控制提供方法参考。

关键词：中药化学;薄荷;配方颗粒;高效液相色谱法;含量测定

中图分类号：R284.1文献标识码：ADOI： 10.7535/hbgykj.2021yx03004

Abstract：In order to improve the quality standard of Herba Menthae formula granules and establish a quantitative evaluation system of multiple indexes， the contents of caffeic acid， hesperidin， rosmarinic acid， diosmin， didymin and buddleoside in Herba Menthae formula granules were determined by using the method of HPLC. The analysis was carried out on Poroshell 120 EC-C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） by gradient elution with methanol （A）-acetonitrile （B）-5% acetic acid （C） as the mobile phase at the flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. The detective wavelength were 330 nm for caffeic acid， rosmarinic acid and buddleoside， 284 nm for hesperidin and didymin， 380 nm for diosmin， respectively. The results show that the linear relationship， separation and repeatability of the six constituents in Herba Menthae formula granules all meet the requirements. The average recovery rates of the constituents are 99.19%， 98.06%， 100.45%， 98.90%， 100.17% and 99.78%， respectively. There are certain differences in the six chemical constituents in Herba Menthae formula granules from different manufacturers. The method of HPLC is simple， accurate and reproducible， which can provide a method reference for the quality control of Herba Menthae formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese material medical; Herba Menthae; formula granules; HPLC; content determination

薄荷为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分，其性凉，味辛，归肺、肝经，具有疏散风热，清利头目等功效[1]。现代研究表明，薄荷所含化学成分复杂，主要有挥发油类、黄酮类、有机酸、氨基酸等化学成分[2]，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和抗生育等多种药理作用[3]。目前有关薄荷的研究主要集中于其挥发油部分，薄荷传统用药方式主要为水煎，因此挥发油并非其唯一药效成分，但是关于薄荷非挥发性化学成分以及质量控制的研究相对较少。徐晶晶等[4]建立了薄荷药材特征图谱，并釆用DPPH法、FRAP法分别测定其抗氧化活性，通过谱效关系研究表明薄荷中对抗氧化作用贡献较大的化合物成分主要为黄酮类和酚酸类。薄荷黄酮类化合物目前主要分离出橙皮苷、蒙花苷、香叶木苷、香蜂草苷、香叶木素、芦丁等，研究表明薄荷黄酮主要具有良好的抗炎、抗氧化、抗病毒等作用[5-6]。薄荷酚酸类化合物主要有迷迭香酸、咖啡酸、顺式丹酚酸、紫草酸等，也是薄荷抗炎、抗菌、抗氧化活性的主要成分，与其临床疗效紧密联系[7-8]。

配方颗粒是现代中药饮片重要的发展形式，薄荷配方颗粒是以优质的薄荷饮片为原料，以水为溶媒经现代工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成的单味中药颗粒剂，具有服用量小，携带保存方便，卫生安全等优点[9-12]。目前薄荷配方颗粒水溶性指标成分为迷迭香酸，但是依靠单一成分定量的标准具有较强的局限性，因此需要建立薄荷配方颗粒中多指标定量的评价体系。目前采用高效液相色谱法同时测定薄荷配方颗粒中非挥发性成分咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木素、香蜂草苷和蒙花苷的含量未见文献报道，本实验采用HPLC-DAD法同时测定薄荷配方颗粒中上述6种成分的含量，为薄荷配方颗粒质量的有效控制提供方法参考和数据支撑。第3期田伟，等：HPLC法同时测定薄荷配方颗粒中6种成分的含量河北工业科技第38卷

1仪器与试剂

1.1仪器

LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司提供;Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国安捷伦公司提供;TB-215D电子天平（十万分之一），BSA224S-CW电子天平（万分之一），德国赛多利斯集团提供;KQ-250型超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz），昆山超声仪器有限公司提供。

1.2试剂

咖啡酸对照品（批号为110885-200102，纯度为100.0%），橙皮苷对照品（批号为110721-201818，纯度为96.2%），均购自中国食品药品检定研究院;迷迭香酸对照品（批号为111820-201404，纯度为98.0%），蒙花苷（批号为111528-201509，纯度为98.0%），均购自成都曼斯特生物技术有限公司;香叶木苷对照品（批号为PS020083，纯度为98.0%），香蜂草苷对照品（批号为PS14081801，纯度为98.0%），均购自成都普思生物科技股份有限公司;薄荷配方颗粒（编号为S1—S12）分别购自神威药业集团有限公司、江阴天江药业有限公司、华润三九医药股份有限公司、四川新绿色药业科技发展股份有限公司、广东一方制药有限公司、北京康仁堂药业有限公司;乙腈、乙酸为色谱纯，美国Fisher公司提供;水为超纯水。

2实验方法

以薄荷配方颗粒为研究对象，参考文献[11]—文献[22]设计实验方案，完成方法学考察。

2.1对照品溶液的制备

精密称取咖啡酸对照品、迷迭香酸对照品、香蜂草苷对照品适量分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得质量浓度为0.384 8 mg/mL的咖啡酸储备液、0.645 2 mg/mL的迷迭香酸储备液、0.117 6 mg/mL的香蜂草苷储备液;精密称取橙皮苷对照品、香叶木苷对照品、蒙花苷对照品适量分别置于5 mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀即得质量浓度为2.472 0 mg/mL的橙皮苷储备液、1.256 0 mg/mL的香叶木苷储备液、2.900 0 mg/mL的蒙花苷储备液;分别精密吸取各储备液适量置于同一50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得每1 mL含咖啡酸7.70 μg、橙皮苷24.72 μg、迷迭香酸38.71 μg、香叶木苷12.56 μg、香蜂草苷7.06 μg、蒙花苷29.00 μg的混合对照品储备液。

2.2供试品溶液的制备

取薄荷配方颗粒适量，研细，取约0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数（下同）75%的甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，加75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3阴性对照溶液的制备

取糊精适量，按照2.2项中供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.4色譜条件

色谱柱为Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以甲醇（A）-乙腈（B）-5%冰乙酸（C）为流动相，梯度洗脱程序见表1;咖啡酸、迷迭香酸、蒙花苷的检测波长为330 nm，橙皮苷、香蜂草苷的检测波长为284 nm，香叶木苷的检测波长为380 nm;流速为0.6 mL/min;柱温为35 ℃。

2.5方法学考察

2.5.1 专属性试验

精密吸取阴性对照溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按2.4项中色谱条件（检测波长为284 nm）测定，结果表明在该色谱条件下，辅料对样品测定无干扰。结果见图1。

2.5.2线性关系考察

精密量取2.1项中混合对照品溶液0.5，1，2，4，6 mL，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到系列浓度的6 种成分混合对照品溶液。分别精密吸取上述溶液及储备液10 μL，按 2.4项中色谱条件（检测波长为284 nm）测定，记录峰面积。以峰面积为因变量、浓度为自变量进行线性回归分析，各组分在其相应的浓度范围内线性关系良好，见表 2。

2.5.3精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，计算咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷的峰面积RSD分别为0.40%，0.32%，0.26%，0.26%，0.44%，0.27%，表明仪器精密度良好。

2.5.4稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0，2，6，12，20，30 h进样10 μL，按2.4项中色谱条件测定，计算咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷的峰面积RSD分别为0.16%，1.29%，0.81%，0.20%，1.19%，1.28%（n=6）。结果表明，供试品溶液在30 h内稳定性良好。

2.5.5重复性试验

取同一批薄荷配方颗粒样品（S9），分别取低（0.125 g）、中（0.25 g）、高（0.375 g）3个样品量，每个样品量3份，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按2.4项中色谱条件测定，计算得到样品中咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷的平均含量（质量分数，下同）分别为0.38，1.30，1.79，0.58，0.22，1.14 mg/g，RSD分别为0.77%，1.05%，1.21%，2.37%，2.14%，2.53%（n=6）。结果表明该方法重复性良好。

2.5.6加样回收率试验

取同一批已知含量的薄荷配方颗粒（S9）9份，按每3份为一组，每组精密加入对照品咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷的量相当于薄荷配方颗粒中各对照品含量的50%，100%，150%，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按2.4项中色谱条件测定，分别计算咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷的回收率，结果见表3-表8。

3结果及分析讨论

3.1样品测定

取不同厂家、不同批号的薄荷配方颗粒适量，研细，各取约 0.25 g，精密称定，分别按照2.2项中制备供试品溶液，按照2.4项中色谱条件进样10 μL，测定咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷的含量，结果见表9。

3.2分析讨论

本研究采用二极管阵列检测器对6种指标成分进行200～400 nm全波长扫描，发现咖啡酸、迷迭香酸和蒙花苷在330 nm处均有较大紫外吸收，橙皮苷和香蜂草苷在284 nm处有较大吸收，香叶木苷在345 nm处有最大吸收，但是在此波长下香叶木苷与相邻峰无法实现基线分离，在380 nm波长时香叶木苷仍有较大紫外吸收，而影响香叶木苷测定的干扰峰在此波长下无紫外吸收，因此选择380 nm作为香叶木苷的检测波长。

橙皮苷、迷迭香酸和香叶木苷3种成分的色谱峰保留时间较为接近，考察乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-5%乙酸、甲醇-乙腈-5%乙酸等多种流动相系统，最终发现以甲醇-乙腈-5%冰乙酸作为流动相，采用梯度洗脱，混合对照品溶液和供试品溶液中6种待测指标成分色谱峰峰形均较好，分离度符合要求。

结果表明，不同厂家以及相同厂家不同批号的薄荷配方颗粒含量存在一定差异。造成此差异的因素很多，其中最重要的因素有2个：一为原料，二为生产工艺。有研究报道表明，部位、采收期、产地的不同均对薄荷药材中有效成分的含量有不同程度的影响[23]。此外，不同厂家所采用的提取、干燥工艺不同也可能导致指标成分的差异。制剂工艺主要影响薄荷中有效成分的溶出与转化、辅料用量等。在薄荷标准汤剂的研究中发现，咖啡酸在标准汤剂中的转移率超过了150%，多批次薄荷标准汤剂样品超过了200%。薄荷中迷迭香酸、丹酚酸等有机酸均含有咖啡酸的结构，在煎煮过程中可能发生化合键的断裂从而生成咖啡酸。有研究表明迷迭香酸的抗氧化能力强于咖啡酸[24]，因此为保证薄荷配方颗粒的质量和临床疗效应严格控制提取、浓缩等工艺条件。

4结语

薄荷配方颗粒中非挥发性成分是发挥药效的重要成分，目前，采用高效液相色谱法同时测定薄荷配方颗粒中多种非挥发性成分的方法鲜有报道[11]。本实验通过对流动相、检测波长、提取方法等进行考察，最终确定了采用 HPLC法同时测定薄荷配方颗粒中咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷6种成分的含量，以甲醇-乙腈-5%冰乙酸为流动相，梯度洗脱，流速为0.6 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长分别为咖啡酸、迷迭香酸、蒙花苷采用330 nm，橙皮苷和香蜂草苷采用284 nm，香叶木苷采用380 nm。结果表明，咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木苷、香蜂草苷和蒙花苷分别在0.39～7.70，1.24～24.72，1.94～38.71，0.63～12.56，0.35～7.06，1.45～29.00 mg/L呈现良好的线性关系，相关系数r均大于0.999 7，各成分的平均回收率分别为99.19%，98.06%，100.45%，98.90%，100.17%，99.78%。该方法简便快速、重复性好、专属性强，可以为薄荷配方颗粒质量的有效控制提供方法参考和科学依据。

薄荷中含有多种黄酮类和酚酸类成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒等药理作用，与其临床疗效密切相关。本文仅对薄荷配方颗粒中6种成分进行了同时测定，未来应继续深入研究薄荷配方颗粒中的其他黄酮类和酚酸类成分。中药指纹图谱是一种全面反映中药或中药制剂整体性化学特征的质量分析方法，被广泛应用于中药及中药制剂的质量控制，而目前薄荷配方颗粒中多个色谱峰未能指认，未来可以通过多成分含量测定和指纹图谱相结合的方式全面控制薄荷配方颗粒的质量。

参考文献/References：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]华燕青.薄荷化学成分及其提取方法研究进展[J].陕西农业科学，2018，64（4）：83-86.

[3]高榆嘉，張文静，刘萌，等.薄荷药理作用的研究进展[J].吉林医药学院学报，2020，41（3）：215-217.

[4]徐晶晶，刘斌.基于DPPH、FRAP法的薄荷药材抗氧化谱效关系研究[J].北京中医药大学学报，2015，38（6）：405-410.

XU Jingjing， LIU Bin. Spectrum-effect relation in antioxidant activity of Menthae haplocalycis Herba based on DPPH and FRAP assay[J]. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine， 2015， 38（6）： 405-410.

[5]陈向阳，张乐，吴莹，等.LCMS-IT-TOF 法快速分析薄荷黄酮部位的主要化学成分[J].北京中医药大学学报，2015，38（8）：546-550.

CHEN Xiangyang， ZHANG Le， WU Ying， et al. Rapid analysis of chemical compositions in the flavonoid fraction of Mentha haplocalyx Briq. with LCMS-IT-TOF[J]. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine， 2015， 38（8）：546-550.

[6]钟昆芮，张凡，姜艳艳，等.薄荷总黄酮的纯化工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：11-14.

ZHONG Kunrui， ZHANG Fan， JIANG Yanyan， et al. Optimization of purification technology for total flavonoids from Mentha haplocalyx[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2013， 19（6）： 11-14.

[7]陈向阳.薄荷酚类部位化学成分及抗炎活性研究[D].北京：北京中医药大学，2016.

[8]周德勇，张乐，姜艳艳，等.薄荷酚类对照提取物HPLC含量测定研究及其在薄荷药材质量控制中的应用[J].药物分析杂志，2018，38（4）：582-589.

ZHOU Deyong， ZHANG Le， JIANG Yanyan， et a1. HPLC assay of phenolic reference extract of mint and its application in quality evaluation of the herb[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis， 2018， 38（4）： 582-589.

[9]張红梅，宋景政，谭红胜，等.从汤剂到颗粒剂：中药配方颗粒20年回顾与展望[J].世界科学技术-中医药现代化，2012，14（4）：1740-1753.

ZHANG Hongmei， SONG Jingzheng， TAN Hongsheng， et a1.From traditional decoction to modern granule： Perspectives and prospects of Chinese medicine dispensing granules[J]. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology， 2012， 14（4）： 1740-1753.

[10]江丽杰，胡镜清，杨响光，等.临床医生对中药配方颗粒应用认知初步调查[J].中成药，2011，33（2）：326-328.

[11]田伟，甄亚钦，王鑫国，等.HPLC法同时测定薄荷配方颗粒中3种成分[J].中成药，2016，38（12）：2602-2605.

TIAN Wei， ZHEN Yaqin， WANG Xinguo， et a1. Simultaneous determination of three constituents in Bohe Dispensing Granules by HPLC[J]. Chinese Traditional Patent Medicine， 2016， 38（12）： 2602-2605.

[12]甄亚钦，田伟，李斯，等.HPLC法同时测定荆芥配方颗粒中4种成分的含量[J].中药材，2016，39（10）：2285-2287.

[13]田伟，甄亚钦，范帅帅，等.高效液相色谱法同时测定车前子配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量[J].中国药学杂志，2018，53（2）：140-144.

TIAN Wei， ZHEN Yaqin， FAN Shuaishuai， et a1. Simultaneous determination of geniposidic acid， caffeic acid， acteoside and isoacteoside in Plantaginis Semen formula granules by HPLC[J]. Chinese Pharmaceutical Journal， 2018， 53（2）： 140-144.

[14]孙福仁，高晗，李雪利，等.佛手标准汤剂中两种成分的测定方法研究[J].河北工业科技，2019，36（3）：221-226.

SUN Furen， GAO Han， LI Xueli， et a1. Simultaneous determination of two constituents in standard decoction of Citri sarcodactylis fuctus by UPLC[J]. Hebei Journal of Industrial Science and Technology， 2019， 36（3）： 221-226.

[15]王迎春，麻景梅，王梦，等.基于相关性的麻黄配方颗粒HPLC特征图谱研究[J].河北工业科技，2020，37（4）：286-290.

WANG Yingchun， MA Jingmei， WANG Meng， et al. Correlation study on HPLC characteristic chromatograms of Ephedra formula granules[J]. Hebei Journal of Industrial Science and Technology， 2020， 37（4）： 286-290.

[16]耿彦梅，高晗，孙福仁，等.苍耳子标准汤剂质量研究[J].河北工业科技，2019，36（2）：122-127.

GENG Yanmei， GAO Han， SUN Furen， et al. Study on quality of Xanthii Fructus standard dection[J]. Hebei Journal of Industrial Science and Technology， 2019， 36（2）： 122-127.

[17]吴佳妮，夏书雪，李雪梅，等.薄荷标准汤剂的指纹图谱及成分分析[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（16）：128-134.

WU Jiani， XIA Shuxue， LI Xuemei， et al. HPLC fingerprint and chemical constituents of Menthae Haplocalycis Herba standard decoction[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2019， 25（16）： 128-134.

[18]张肖建，张岩岩，高晗，等.牛蒡子标准汤剂质量评价体系的建立[J].河北工业科技，2019，36（1）：47-52.

ZHANG Xiaojian， ZHANG Yanyan， GAO Han， et al. Establishment of quality evaluation system for standard decoction of Arctii fructus[J]. Hebei Journal of Industrial Science and Technology， 2019， 36（1）： 47-52.

[19]徐晶晶，徐超，刘斌.不同采收期薄荷中4个黄酮苷的含量测定[J].药物分析杂志，2013，33（12）：2077-2081.

XU Jingjing， XU Chao， LIU Bin.HPLC simultaneous determination of four flavone glycosides in Menthae Haplocalycis Herba during different harvest periods [J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis， 2013， 33（12）： 2077-2081.

[20]許世富.高效液相色谱法测定清肺颗粒中甘草酸的含量[J].现代农业科技，2020（7）：222-223.

XU Shifu. Determination of glycyrrhizic acid content in Qingfei granule by HPLC[J]. Modern Agricultural Science and Technology， 2020（7）： 222-223.

[21]姚沅平，李柯，符国成，等.五指柑药材质量标准研究[J].中药新药与临床药理，2020，31（2）：219-223.

YAO Yuanping， LI Ke， FU Guocheng， et al. Study on quality standard of Herba Viticix negundo[J]. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology， 2020， 31（2）： 219-223.

[22]陈晶晶，张振凌，曹淼淼，等.百药煎HPLC指纹图谱的建立及其中5种成分的含量测定[J].中国药房，2020，31（2）：173-178.

CHEN Jingjing，ZHANG Zhenling， CAO Miaomiao， et al. Establishment of HPLC fingerprint of Chinese gall leaven and content determination of 5 Components[J]. China Pharmacy， 2020， 31（2）： 173-178.

[23]胡少伟，钟昆芮，杨佳颖，等.薄荷茎、叶中黄酮类成分在不同采收期的含量差异性研究[J].中国中药杂志，2018，43（3）：544-550.

HU Shaowei， ZHONG Kunrui， YANG Jiaying，et al. Study on difference of flavonoids content in stems and leaves of Mentha Haplocalycis Herba in different harvest periods[J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 2018， 43（3）： 544-550.

[24]罗思琳.不同抗氧化剂抗氧化性能的比较及其对小鼠采食量影响的研究[D].广州：华南农业大学，2016.

LUO Silin. A Comparative Study on the Antioxidant Activity of Different Antioxidants and Their Effects on Food Intake in Mice[D].Guangzhou： South China Agricultural University， 2016.