脱落酸对水稻种子萌发期耐高温胁迫的诱抗效应

杨雲雲，陈 鑫，陈启洲，卢 芳，徐 晨，杨洪涛，苏佩佩，刘晓龙

(1.宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000；2.吉林省农业科学院 农业资源与环境研究所，吉林 长春 130033)

长江中下游地区是我国重要的水稻主产区，近年来，由于气候变暖导致的夏季极端高温天气时有发生，最高温度超过35 ℃的天气持续10～15 d。高温胁迫已对当地的水稻生产造成严重影响，并已成为制约当地水稻种植业发展的主要限制因素之一。高温胁迫会对不同生育时期的水稻生长造成影响，在种子萌发期遭遇超过35 ℃的高温胁迫会导致种子发芽迟缓、种子丧失活力、发芽率下降[1]。水稻在幼苗阶段遭受高温胁迫不仅会出现叶片卷曲，含水量降低，叶片颜色变浅、变白、变短和畸形等症状，还会致使植株生长发育缓慢、抑制根系生长[2-3]，光合作用受阻，净光合速率和气孔导度降低，光合作用原初反应受到抑制[4-5]。水稻孕穗期遭遇高温胁迫会导致颖花退化、花粉败育、花粉活力下降，进而导致秕粒增加[6-7]；在抽穗期和灌浆期遭受高温胁迫会阻碍水稻的开花授粉，穗中秕粒增多、结实率下降，造成千粒质量降低，进而导致水稻减产[8-11]。研究表明，水稻幼苗在碱胁迫环境下，根系活性氧大量积累，破坏了抗氧化防御系统，进而损伤根系细胞，导致幼苗萎蔫和死亡[12]。高温胁迫与碱胁迫类似，其抑制水稻生长发育的一个重要因素就是引起ROS过量积累，破坏ROS产生和清除的平衡体系，导致膜质过氧化作用加剧，进而损坏细胞结构[3，13-14]。高温胁迫抑制水稻种子萌发，但其导致发芽率下降的主要原因尚不明确，本研究拟以ROS积累为线索探究高温胁迫抑制水稻种子萌发的机制。

脱落酸(ABA)是植物体内的重要激素，常作为胁迫激素参与植物对多种逆境胁迫的响应，并发挥重要作用[15]。产生诱抗效应是ABA提高植物抗逆性的一个重要机制[16]。ABA对水稻耐盐碱胁迫产生诱抗效应，能够提高水稻对碱胁迫的抗性和苏打盐碱水田中的产量[17-18]。ABA在提高植物耐高温胁迫中同样具有促进作用，高温处理可降低植物体内IAA、GA、自由脯氨酸及可溶性蛋白质的含量，增加脱落酸含量[19]。抽穗期喷施S-诱抗素或ABA溶液能够提高水稻的结实率和千粒质量，稻米的碾磨品质和蒸煮品质也得到改良[20]。研究表明，外源ABA能够通过增加蔗糖的转运和加速蔗糖代谢来保持碳平衡和能量平衡，进而阻止花粉败育[21]。以上研究结果为ABA提高水稻耐高温特性的效果提供了坚实的科学依据，但目前对于其内在的生理机制及分子机理解析尚不明晰，尤其在ROS相关通路中的报道并不多见。研究表明，ABA预处理能够提高碱胁迫下水稻幼苗的下游抗氧化防御能力，抑制ROS过量积累；且ABA缓解了外源二氯百草枯(Paraquat)对水稻幼苗引发的氧化胁迫，这是ABA诱导水稻耐碱胁迫的主要途径之一[22]。基于以上研究结果，本研究以高温为主要非生物胁迫因子，探究ABA对水稻耐高温胁迫的诱抗效应，以ABA浸种的方式在水稻种子萌发期进行研究，并以ROS积累为出发点初步解析高温环境下ABA对水稻种子萌发的影响机理。

1 材料和方法

1.1 供试材料

以江西省主推常规水稻品种黄华占和日本晴为试验材料。

1.2 试验设计

1.2.1 ABA溶液的配制 脱落酸(ABA：Sigma，Inc.，St，Louis，MO，USA)试剂先溶于少量的无水乙醇中，然后用去离子水定容至一定的浓度。本试验用外源ABA浸种的方式探究ABA对水稻种子萌发的诱抗效应，参照前人研究结果，选用10 μmol/L作为试验用ABA浓度[17-18，22]。

1.2.2 试验设计 萌发试验在培养皿中进行，设置2个处理，即非ABA处理组(-ABA)和ABA处理组(+ABA)，每个处理5次重复。每个重复选取饱满一致的50粒种子，ABA处理组用10 μmol/L的ABA溶液于黑暗条件下浸种24 h，非ABA处理组用去离子水于黑暗条件下浸种24 h。

1.3 各项指标的测定方法

1.3.1 相对电导率和丙二醛含量的测定 相对电导率(Relative conductivity，RC)常用来评价细胞膜的损伤程度。用煮沸前和煮沸后的电导率(R1和R2分别表示煮沸前后溶液的电导率)来计算，公式为：RC(%)=R1/R2×100%。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸显色法测定，采用公式6.45×(A532-A600)-0.56×A450计算各样品的MDA浓度，再根据样品质量计算MDA含量。

过氧化氢含量的测定：植物中的H2O2与硫酸钛(或氯化钛)反应生成黄色的过氧化物-钛复合物沉淀，在H2SO4中进行溶解，在415 nm处有特征吸收峰，用分光光度计比色可测定H2O2含量[25]。

1.3.3 萌发相关基因的表达分析 利用TRIzol法提取水稻幼芽总RNA，并测定RNA浓度，用M-MLV反转录酶(TaKaRaBioInc.，Otsu，Japan)进行反转录，形成cDNA。在实时荧光定量PCR仪(Eco TM 48，Illumina，Saffron Walden，UK)上进行qRT-PCR反应(Quantitative real-time PCR)，总反应体系为20 μL，包括：10 μL 2×SYBRPremixExTaqTM(TaKaRa Bio)，1.6 μL cDNA，0.8 μL引物和7.6 μL ddH2O。qRT-PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，30个循环；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。确定cDNA模板和引物没有基因组DNA污染后，以稳定表达的水稻看家基因β-actin作为内参，进行基因表达量的测定。每个处理设置3次生物学重复，每个模板2次技术重复，利用2-ΔΔCT的方法计算基因的相对表达量[26]。

ROS清除相关基因包括：OsCATB、OsAPX6、OsFe-SOD和OsCu/Zn-SOD；细胞死亡相关基因包括：OsBI1和OsKOD1；ABA应答基因有Salt和OsWsi18[12，22]，用于qRT-PCR的基因及相关引物(5′-3′)如下：

OsACT1(内参，Os03g0718100)F：TTCCAGCCTT

CCTTCATA，R：AACGATGTTGCCATATAGAT；

OsBI1(Os02g0125300)F：CTACATCAAGCACGC

ACTC，R：ACCTCTTCTTCCTCTTCTTCTC；

OsKOD1(Os04g0507950)F：TCAAGCCATTCATC

TTCCAT，R：ATCAGCAACCTCGTCAAG；

Salt(Os01t0348900)F：CGAAATAATGTTCCATG

GTGTT，R：TGTACTACGGATCGGTGCAA；

OsWsi18(Os01g0705200)F：TGTGACTCGATCCA

GCGTAG，R：GTTCCTGCTGAGAAGCCATC；

OsCATB(Os06g0727200)F：GCTGGTGAGAGATACC

GGTCA，R：TCAACCCACCGCTGGAGA；

OsAPX6(Os12g0178100)F：CCCCAAGATCCCCA

TGATCTA，R：CCTCTGGCGGGCATTG；

OsFe-SOD(Os06g0143000)F：CGACGCCGAGGAAT

TTCTAG，R：AGGTGGTGTAAGTGTCTCTCATGC；

OsCu/Zn-SOD(Os06g0130900)F：TGTGACGGGA

CTTACTCCTGG，R：CACCCATTCGTAGTATCGCCA。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2013软件进行数据统计，数据绘图应用Origin 9.1绘图软件。利用SPSS 21.0(IBM Corp.，Armonk，NY)软件，基于单因素方差分析(ANOVA)和Duncan方法进行数据的显著性差异分析，显著性差异水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 ABA浸种预处理对高温胁迫下水稻种子萌发的影响

不同处理下，种子萌发试验结果如图1所示。非高温处理下，ABA浸种与否对种子萌发无明显影响。高温胁迫抑制了日本晴和黄华占的种子萌发，导致芽长和根长缩短。而ABA浸种能够促进高温胁迫下水稻种子的萌发和幼芽的生长。

发芽率统计试验结果表明(图2)，ABA浸种在高温胁迫初期促进了水稻种子的萌发。非ABA浸种条件下，与CK-ABA相比，高温处理使日本晴在第2天和第3天的发芽率分别提高了11.60，7.60百分点，使黄华占在第2天，第3天的发芽率分别提高了14.00，4.00百分点。ABA浸种条件下，与CK+ABA相比，高温处理使日本晴在第2天，第3天的发芽率分别提高了7.60，9.20百分点，使黄华占在第2天，第3天的发芽率分别提高了14.40，6.80百分点。随着萌发时间的延长，不管ABA浸种与否，高温胁迫均抑制了水稻种子的萌发。在萌发的第7天，高温胁迫使ABA浸种和非ABA浸种的日本晴发芽率分别下降了12.00，22.80百分点，黄华占分别下降了10.40，20.00百分点。

对照条件下，ABA浸种的种子发芽率略低于非ABA浸种。而高温胁迫下，ABA浸种对水稻种子的萌发起到了一定的促进作用，且胁迫时间越长，促进作用越明显。从萌发的第5 天开始，高温胁迫条件下，ABA浸种提高了2个水稻品种的发芽率；在萌发的第6天，ABA浸种使日本晴和黄华占的发芽率分别提高了4.40，6.80百分点；第7天，ABA浸种使日本晴和黄华占的发芽率分别提高7.60，8.00百分点。

ABA浸种促进了水稻芽和根的生长。试验结果表明(图3)，对照条件下，ABA浸种对水稻幼芽和根的生长略有促进作用，ABA浸种显著提高了黄华占的主根长(P<0.05)。高温胁迫下，ABA浸种显著提高了水稻的芽长和主根长(P<0.05)，黄华占的芽长增加更明显。高温胁迫下，ABA浸种使日本晴和黄华占的芽长分别提高了21.96%，38.92%；主根长分别提高了48.00%，63.82%。

2.2 ABA浸种对高温胁迫下水稻幼芽ROS积累的影响

研究表明，外源ABA预处理显著上调了多个ROS清除基因的表达，提升抗氧化酶活性，进而抑制ROS过量积累来提高水稻幼苗的耐碱性。在这些ROS清除基因中上调幅度较大的有OsCATB、OsAPX6、OsFe-SOD、OsCu/Zn-SOD，分别为过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)的主要调控基因[22]。本试验继续分析高温胁迫下ABA浸种对以上4个ROS清除基因表达的影响。结果表明(图5)，高温胁迫下，ABA浸种显著上调了4个ROS清除基因的表达(P<0.05)，且OsFe-SOD和OsCu/Zn-SOD的上调幅度更大，暗示着ABA浸种提高了抗氧化酶CAT、APX和SOD的活性以清除过多的ROS。

2.3 ABA浸种对高温胁迫下水稻幼芽细胞死亡的影响

研究表明，逆境胁迫下ROS的过量积累是导致水稻细胞损伤和幼苗萎蔫的主要原因[12]，本试验进一步对高温胁迫下水稻幼芽的细胞损伤状况进行测定。由图6可知，高温胁迫条件下，ABA浸种处理使幼芽中细胞死亡抑制基因OsBI1的表达量显著上调(P<0.05)，而细胞死亡基因OsKOD1表达下调，进而降低了高温胁迫导致的细胞过量死亡。高温胁迫下，与非ABA浸种处理相比，ABA浸种使2个品种OsBI1的上调幅度分别为182.0%，156.0%，而细胞死亡基因OsKOD1则分别下调了33.5%，51.3%。

2.4 高温胁迫下水稻种子萌发与幼芽生理指标的相关性分析

2.5 高温胁迫下水稻幼芽ABA应答基因表达量的变化

进一步分析了2个ABA应答基因的表达变化，结果如图7所示。高温胁迫下，ABA浸种处理下水稻幼芽内ABA应答基因显著(P<0.05)上调，说明ABA浸种激活了水稻内的ABA信号通路，使之在抵抗高温胁迫中发挥作用。高温胁迫下，与非ABA浸种处理相比，ABA浸种使日本晴和黄华占幼芽内Salt基因相对表达量分别提高了4.84，5.46倍(图7-A)，OsWsi18分别提高了5.87，7.06倍(图7-B)。

表1 高温胁迫下非ABA浸种处理下水稻种子萌发进程中各指标的相关性分析Tab.1 Correlation analysis of various indexes in rice seed germination process of non-ABA soaking treatment under high temperature stress condition

表2 高温胁迫下ABA浸种处理下水稻种子萌发进程中各指标的相关性分析Tab.2 Correlation analysis of various indexes in rice seed germination process of ABA soaking treatment under high temperature stress condition

3 讨论与结论

良好的种子萌发率是植物适应环境的先决条件。一般来说，水稻在种子萌发期对高温胁迫具有较强的抵抗力，这是因为诱导了种子中小热激蛋白的表达，进而能够帮助种子抵御高温；但超过35 ℃时水稻种子的萌发受阻，种子丧失活力，发芽率降低[27]。本研究结果表明，在萌发初期(前3 d)，水稻种子在30 ℃的环境和40 ℃的高温环境下均能够正常萌发，且高温处理对种子萌发具有促进作用，发芽率略高于对照处理，这可能是由于种子经24 h浸泡后，含水量增加，能够在短期内抵抗高温的缘故，这与前人研究结果基本一致[28]。在萌发初期，对照条件和高温胁迫下，ABA浸种对种子萌发有抑制作用，2个品种的发芽率略低于非ABA浸种处理。随着萌发进程的推进，不管ABA浸种与否，与对照相比，高温胁迫均抑制了水稻种子的萌发；在萌发的第7 天，2个品种的发芽率在高温处理下较对照均有不同程度的下降，且芽长和主根长显著(P<0.05)低于对照处理，这与多数研究结果基本一致[29-31]。不管ABA浸种与否，在对照条件下，品种黄华占的芽长和主根长高于日本晴；且在高温胁迫下的芽长和主根长的下降幅度以及幼芽内ROS积累和质膜损伤程度均低于日本晴，说明黄华占在种子萌发期对高温的抗性略高于日本晴。

ABA不仅参与调控植物的多种生长发育进程，且在植物应对盐、碱、低温和高温等非生物胁迫和多种生物胁迫中发挥重要作用[15，32]。ABA调控植物抗逆性的一种重要机制就是产生诱抗效应，通过浸种和浸根等多种方式赋予植物抵抗逆境的潜在能力[18，22-33]。研究表明，水稻种子或幼苗经ABA预处理后能够提高盐胁迫下幼苗的生长发育和最终产量[34-35]；水稻幼苗经外源ABA浸根预处理后，能够提高抗氧化清除能力，抑制ROS的过量积累，进而提高对碱胁迫的抗性和苏打盐碱水田中的产量[17-18，22]。在高温胁迫下，外源ABA能够通过多种途径缓解高温胁迫对水稻的伤害，包括调控能量平衡、ROS积累和糖代谢等途径，促进水稻生长发育和产量形成[2，21，36]。本试验结果表明，种子萌发初期，在对照和高温处理下，外源ABA浸种较非ABA浸种在一定程度上抑制了种子的萌发。在长期高温胁迫下，外源ABA浸种加快了水稻种子的萌发速度，促进了幼芽和幼根的生长，缓解了长期极端高温胁迫对水稻种子幼芽生长的抑制作用。对其内在机制进一步研究发现，高温胁迫下，ABA浸种显著(P<0.05)上调了ABA应答基因Salt和OsWsi18的表达量，说明ABA信号途径被激活，进一步提升了高温胁迫下水稻幼芽抗氧化清除基因的转录表达，降低ROS的含量，进而缓解了水稻幼芽的质膜损伤和细胞过量死亡，促进幼芽的生长。

综上所述，本研究探究了高温胁迫下ABA浸种对水稻种子萌发的影响，进一步验证了外源ABA对水稻抗逆性的诱抗效应。水稻种子在萌发初期，高温处理能够短暂的促进种子萌发；此后，高温处理导致幼芽内ROS过量积累，并进一步导致细胞损伤，进而抑制了幼芽的生长。种子在萌发前利用外源ABA浸种能够起到提高抗氧化清除能力的作用，降低由极端高温胁迫而引起的ROS过量积累，从而缓解细胞损伤，促进高温胁迫下水稻幼芽及幼根的生长。