大麻FT同源基因CsHd3a的克隆及表达谱分析

李 铮，潘 根，陶 杰，黄思齐，唐慧娟，邓 勇，赵立宁，李德芳

(中国农业科学院 麻类研究所，湖南 长沙 410205)

植物开花时间是影响作物产量的关键因素之一，是植物由营养生长转向生殖生长的标志，花期调控是植物生产中重要的一环[1]。诱导植物成花至少有6条途径：光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主途径、年龄依赖途径和温敏途径等。当环境发生变化(光周期、激素、温度等)，这些途径将植物体内各种因子产生的响应信号转换成新信号后，传递给开花整合子，由它促进花分生组织特异基因的表达，诱导花的形成[2]。FLOWERINGLOCUST(FT)基因是6种途径中最重要的开花整合子之一，也是重要的开花促进基因，对植物成花起着至关重要的作用[3]。研究报道，拟南芥的FT基因突变会导致植株开花推迟，过表达则早开花[4]。在水稻中，Headingdate3a(Hd3a)基因与拟南芥的FT基因具有同源性[5]，二者属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族的FT-Like(FTL)亚家族[6]，在植物中主要参与成花调控、花器官发育等，短日照下具有促进开花的功能。研究表明，拟南芥和水稻等植物在接受合适的光周期诱导后，FTL在叶中被诱导表达，其蛋白质由叶片经过维管束移动到茎顶端组织促进开花[6]。开花提前或延后严重影响了植物的产量和质量，因此，研究FT基因的功能及机理具有重要的理论和实际意义。前人在拟南芥、水稻、小麦、大豆等植物中已成功克隆FT基因家族，并对其遗传因素和分子机制都有深入的研究，但大麻的开花机理尚不明确，大麻开花关键基因的研究鲜见报道。

大麻(Cannabissativa)是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(CannabisL.)一年生草本植物。大麻在中国栽培历史久远，且广泛种植于世界各地，其纤维主要作为优良的纺织和造纸原料[7]；其种子可榨油，作食用油或工业用油[8]；其叶、花、果实等可入药，近年来研究表明，大麻中的非成瘾成分大麻二酚(CBD)有治疗癫痫、失眠症、焦虑、肿瘤等的功效[9-11]；还可用于预防或治疗药物成瘾；甚至可以添加在化妆品中，对皮肤有舒缓修复、祛痘、抗皱等作用[12]。大麻的价值主要来源于其茎、叶和花中，但由于其属于短日照植物，对光照变化十分敏感[13]，南种北移后生育期延长，出现晚花、无法收获种子或种子结实不饱满等现象[14]，收获期延后也增加了人工成本；北种南引后生育期大大缩短，出现早花或植株发育不良等情况，纤维及花叶产量大大减少[15]。因此，培育大麻广适应品种是当前大麻育种的热点之一，而大麻开花期机理研究可为其提供理论支撑，但目前光周期影响大麻开花的分子机理尚不明确，限制了其在大麻育种中的应用。

本研究以云麻7号(Y7)和庆麻1号(Q1)为材料，通过对大麻FT同源基因CsHd3a(CannabissativaHeadingdate-3a)基因进行生物信息学分析、实时荧光定量对其进行组织和长、短日照下相对表达水平分析，为探索CsHd3a转录因子的开花调控机制提供理论依据，为培育大麻广适应性品种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与处理方法

本试验中的大麻品种庆麻1号(Q1)和云麻7号(Y7)皆由中国农业科学院麻类研究所一年生麻类作物育种团队提供。选取大小均匀、颗粒饱满的种子，于湿润的吸水纸上发芽。

1.1.1 大麻植株培养 待第一对真叶展开后，挑选若干发芽的植株移植室外培养，挑选3株长势均匀的开花雌株，各取发育良好且长势均匀的植物组织，迅速放入液氮，用于提取RNA。其余Q1和Y7植株采用盆栽方式放在自然条件下进行种植，待开花后记录其开花期。

1.1.2 不同日照时长的处理 待发出第1对真叶后，移栽至花盆中，放入人工气候室培养(温度25～28 ℃，湿度70%，光照12 h/d)。培养30 d后，选取长势均匀的Y7和Q1植株各6盆，均分为长日照组和短日照组，放置于植物组织培养室进行定时光照培养。长日照组光照时间为每日5：00-21：00，光照时长16 h，黑暗处理8 h；短日照组光照时间为每日8：00-16：00，光照时长8 h，黑暗处理16 h。连续处理7 d后，从00：00开始取样，每隔4 h取一次，到20：00结束，共取6次。取样时，皆选取顶部向下2，3节的叶片，且每次2个品种各取3株，取样后迅速放入液氮冷冻后-80 ℃保存。

1.2 RNA提取

使用EASY spin Plus多糖多酚复杂植物总RNA快速提取试剂盒(艾德莱生物有限公司，北京)提取总RNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和纯度，用Nano Drop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)检测其浓度和纯度。

1.3 引物设计

根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)最新公布的大麻转录组序列信息，使用Primer 5.0进行引物设计(表1)，由北京擎科生物技术有限公司合成序列。

1.4 大麻CsHd3a基因的克隆

选取植物顶部向下第2，3节的叶片，提取大麻总RNA，使用金牌逆转录试剂盒(擎科生物技术有限公司，北京)反转录合成cDNA，以1 μL反转录产物为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，Primer-F(10 mol/mL)1 μL，Primer-R(10 mol/mL)1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 补至25 μL。反应程序：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次； 72 ℃ 5 min，反应于12 ℃终止后取出，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并对目的片段进行切胶回收。选择T载体进行载体连接，并转入DH5α感受态细胞培养，涂布于含有氨苄(Ampicillin)抗生素的LB平板上进行菌落筛选，挑菌培养并做阳性检验后，提取质粒并送至北京擎科生物有限公司测序。得到序列后进入NCBI的Blast模块进行序列比对鉴定，并使用DNAMAN与CsHd3a基因的ORF序列进行比对。

1.5 大麻CsHd3a基因生物信息学分析

通过NCBI中公布的序列，获得CsHd3a基因序列信息，使用BioXM 2.7软件翻译成氨基酸序列。在exPASy-ProteParam网站(https：//web.expasy.org/protparam/)中分析大麻CsHd3a蛋白一级结构的理化特性，包括氨基酸组成、分子量、亲/疏水性、等电点及脂肪指数等。利用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测二级结构，Phyre2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)预测三级结构。利用NCBI的保守域数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)检索保守域并进行分析。通过NCBI获取其他主要作物的FT及同源氨基酸序列信息，使用MEGA 7软件以最大释然法构建系统进化发育树并进行分析。使用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对。

1.6 表达量分析

选取植物顶部向下第2，3节的叶片，提取大麻总RNA，使用Evo M-MLV反转录试剂预混液(湖南艾科瑞生物有限公司，长沙)反转录合成cDNA，选取DHS2作为内参基因(表1)，使用CFX96定量PCR仪(Bio-Rad，USA)采用qRT-PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)技术，选择SYBRR Green Ⅰ染料，采用相对定量法研究Q1雌株中CsHd3a基因在盛花期不同部位的表达特征和CsHd3a基因在Q1、Y7中长、短日照下的表达特征。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

2 结果与分析

2.1 大麻CsHd3a3基因的克隆

根据NCBI中公布的大麻FT同源基因序列设计PCR特异性引物，以Q1叶片为模板进行PCR扩增，通过扩增及琼脂糖凝胶电泳验证(图1)，回收目的条带后，克隆到pTOPO-Blunt平末端连接载体后，转入感受态细胞，经过抗性筛选、阳性检验后进行测序分析，测序结果与NCBI中公布的大麻FT同源基因序列进行氨基酸序列比对一致。其全长CDS序列大小为543 bp，编码180个氨基酸长度的蛋白质，将其命名为CsHd3a。利用DNAMAN软件将Q1克隆出的CDS氨基酸序列与NCBI中公布的大麻FT同源基因序列进行比对，一致性为99.44%(图2)，Q1中编码区第8位氨基酸亮氨酸被替换为脯氨酸。

2.2 大麻CsHd3a蛋白理化特性分析

利用exPASy-ProteParam软件对序列进行预测，CsHd3a蛋白分子式为C900H1387N251O269S5，ORF编码的氨基酸数为180 aa；分子量为20.187 73 ku，理论等电点为7.76，脂肪族指数为30.33，亲、疏水性平均值为-0.418，为较亲水的两性蛋白。利用CDD数据库比对发现，CsHd3a蛋白共含有6个位置略有差异的结构域，其中含有PEBP-euk特殊结构域，属于PEBP家族蛋白(图3)。

CsHd3a蛋白预测的二级结构分析如图4所示，编码该蛋白的180个氨基酸中可能有25个氨基酸形成α螺旋(13.89%)，49个氨基酸形成延伸链(27.22%)，9个氨基酸形成β转角(5.00%),97个氨基酸形成无规则卷曲(53.89%)。利用Phyre2工具进行三级结构预测，结果与二级结构预测结果相一致(图5)。

在NCBI中获得大麻与主要作物[16]的FT-Like蛋白序列，使用DNAMAN进行保守序列比对(图6)。分析发现，氨基酸序列一致性为71.63%，说明FT氨基酸在不同物种间具有高度的相似性。使用MEGA 7的最大释然法构建物种间的FT基因发育进化树(图7)，结果显示，CsHd3a与棉花FT同源基因GhFT1亲缘关系最近。

2.3 大麻CsHd3a基因的组织特异性表达分析

为探究CsHd3a基因在大麻中的组织表达特异性，选用庆麻1号(Q1)为材料，分析其在同一生长时期不同组织中基因的表达情况。如图8所示，可看出CsHd3a基因在叶和花中均有表达，且在叶中高表达，在根和茎中几乎不表达。在叶中的表达量是花的14.9倍，是根的155.3倍，是茎的389.7倍。

2.4 大麻不同品种的CsHd3a基因在长、短日照下的表达特征

为进一步探究CsHd3a在调控大麻开花中的作用，基于前人研究报道，选用北方品种Q1和南方品种Y7进行长、短日照下不同品种大麻CsHd3a基因在叶中表达情况的研究。同时播种35 d后，Y7依旧处于营养生长阶段； Q1已停止营养生长转入生殖生长(图9)，Q1开花期明显早于Y7。

选择将2个品种分别以长(16 h光照)、短(8 h光照)日照处理。处理7 d后，从0：00开始到当日20：00，每隔4 h取样一次，仅选取处理后的叶片组织。通过时空表达模式图(图10)可看出，在短日照处理下，Q1表达量皆高于Y7，且在白天(光照时间为8：00-16：00)表达量明显升高，8：00达到峰值；在Q1植物中，该基因在短日照处理下白天表达量显著上升，而在长日照中几乎不表达；Q1在LD下和Y7在SD下，相对表达量皆低于0.2。

2.5 大麻不同品种CsHd3a基因的克隆

为探究早花品种Q1和晚花品种Y7在短日条件下的差异，利用DNAMAN软件将Y7和Q1克隆出的CDS氨基酸序列进行比对，一致性为97.22%(图11)。Y7蛋白序列存在5处位点发生氨基酸替换，分别是第9位缬氨酸被替换为丙氨酸；第40位甘氨酸被替换为丝氨酸；第42位谷氨酸被替换为甘氨酸；第46位丝氨酸被替换为脯氨酸；第55位天冬氨酸被替换为甘氨酸(图12)。

3 结论与讨论

开花期是重要的生育时期之一，决定大麻营养生长期的长短和不同品种的地域适应性，间接影响了大麻产量和质量，因此，研究大麻光周期调控基因对大麻的实际生产和优良品种培育具有重要意义。研究认为，光周期是影响开花最重要的环境因素之一[17]。植物在感知到有利的或诱导性的日长后，叶片中产生一种称为荧光素的可移动的长途信号，后被传送至茎尖，从而触发花形态的发生，而FT基因mRNA是荧光素信号的重要组成部分[18]。FT在植物开花调控中的作用备受关注，近年来，研究者通过克隆、转基因等分子技术对FT及同源基因进行功能验证，研究发现，在水稻[19]、拟南芥[20]、小麦[21]、大豆[22]、玉米[23]中，其开花功能相当保守，即使发生突变仍能在合适的光照诱导下促进开花；使用基因沉默等技术使其功能失活则延迟开花。FT及其同源基因在多种作物中相继被克隆，但目前尚未见有关大麻FT及同源基因的报道。

本研究从大麻品种Q1中克隆了FT同源基因，命名为CsHd3a基因，其cDNA编码区与GenBank数据库一致性高于99%，保守序列无差异，预测的二级结构和三级结构几乎一致。对大麻CsHd3a蛋白进行生物信息学分析，发现其属于亲水性的不稳定蛋白质，无跨膜结构域，属于非跨膜蛋白。CsHd3a蛋白属于PEBP家族的FT-L亚家族，含有相当保守的PEBP结构域，在植物中被证实其家族基因的存在对激活器官状结构(例如芽和花)的发育存在明显的关系[24]，与其他植物的同源基因比对也有较高的相似度。在不同作物中，FT及其同源基因个数不同，如拟南芥[25]有2个、水稻[6]有25个、大豆[26]有24个。通过FT物种间进化发育树分析，发现拟南芥的AtFT基因与同源基因AtFTL基因的亲缘关系较远，表明同一物种FT家族序列可能存在差异；大麻CsHd3a基因与同为短日照作物的水稻Hd3a基因的亲缘关系较远，其与长日照作物棉花的GhFTL基因亲缘关系较近。同时说明FT的分布具有种属特异性，这也解释了FT及其同源基因在不同物种中行使的功能有所不同，如促进成色[27]、过表达抑制开花、作为细胞自主调节的计时器准确开闭气孔保卫细胞[28]等。

FT及其同源基因是植物成花过程中关键基因，在叶片中高表达后传递荧光素至茎尖，促进成花。CsHd3a基因在开花期的大麻中组织表达量差异较大，其在叶片中表达量最高，花中次之，在茎与根系中几乎不表达，这与前人的研究相一致[29]。Y7和Q1在长、短日照下CsHd3a基因的时空表达表明，Y7在短日照下相对表达量低于0.2，Q1在短日照处理下呈现高表达，且显著高于Y7和长日条件下的Q1。推测Q1在短日照下表现早花与CsHd3a基因高表达有关，在短日照下的成花调控中扮演了重要角色。拟南芥中FT基因突变或不表达导致晚花或不开花，过表达导致植株早花[25]，这与本研究相一致，可见CsHd3a基因在大麻成花过程中可能发挥正向调控的作用。

进一步序列分析表明，在开花期有显著差异的Q1和Y7品种中，其CsHd3a存在多处氨基酸差异，这些差异是否直接影响大麻开花期还有待进一步考证。在水稻中，Kasalath和日本晴等位基因在编码区内有两处碱基替换，从而改变该蛋白羧基端的氨基酸[30]，但这2种等位基因均具有促花功能[31]。水稻Hd3a基因是与可促进拟南芥开花的FT基因高度相似的基因，该基因在日照时长由长变短时诱导表达。在短日条件下，Hd3a转录水平对水稻抽穗期有直接影响，且Kasalath等位基因表达的mRNA早于日本晴等位基因，表达水平也较高[32]。

综上所述，本研究克隆了大麻的FT同源基因CsHd3a基因，对其序列信息及蛋白结构进行预测和分析，该蛋白属于参与开花调控的PEBP家族蛋白；并在开花期对其进行不同组织器官的表达进行分析，该基因在花和叶中都有表达，叶中相对表达量最高，在根和茎中几乎不表达。同时对该基因的时空表达特性进行了研究，该基因在短日照处理下Q1相对表达量显著上调，Y7几乎不表达，结合短日照下Q1表现早花，可推测该基因在短日照下高表达导致开花。进一步克隆得到Y7和Q1序列，比对发现Y7存在5处氨基酸差异，可为进一步探究其调控大麻成花及花发育的分子机制奠定基础。