m6A阅读蛋白IGF2BP1在膀胱癌中的表达及作用

周子健，李 凯，蔡令凯，庄俊涛，杨 潇，杨海伟，李鹏超，吕 强

(南京医科大学第一附属医院泌尿外科，江苏南京 210029)

膀胱癌每年导致全球近17万人死亡，是全球第6大常见肿瘤[1]，具有进展快、侵袭性强和预后不佳的临床特点[2]，故探索其新的生物标志物和治疗靶点至关重要[3]。N6-甲基腺嘌呤(m6A)是真核生物RNA中最常见的修饰之一，参与调节肿瘤进展[4-5]。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)，属于RNA结合蛋白家族的一员[6]，可以促进肿瘤细胞增殖、侵袭和化疗耐药[7]。2018年，IGF2BP1首次被报道可以作为一种新的m6A阅读蛋白，识别mRNA上保守的GG(m6A)C序列，促进目标mRNA的稳定及其翻译[8]。随后研究发现，IGF2BP1以m6A修饰的方式促进转录调节因子SRF转录形成致癌驱动网络[9]。

本团队在之前的研究中已经发现m6A甲基化蛋白METTL3能够以m6A依赖的方式促进膀胱癌肿瘤的增殖[10]，而本次研究主要探讨m6A阅读蛋白IGF2BP1在膀胱癌中的表达及作用。

1 材料与方法

1.1 样本来源膀胱癌组织及其配对的癌旁组织均取自2010至2013年在南京医科大学第一附属医院(江苏省人民医院)确诊为膀胱癌并进行手术的患者。随访的截止日期是2018年1月。所有患者都签署知情同意书。本研究使用的临床样本已得到南京医科大学第一附属医院(江苏省人民医院)伦理委员会的证实。

1.2 细胞培养人膀胱癌细胞系T24、J82、BIU87、TCC细胞株和人正常膀胱上皮细胞系SV-HUC购自中科院上海细胞库。细胞分别用含体积分数为10%的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培养基、1640培养基、F12K培养基，于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。FBS、胰蛋白酶和各类培养基均购自Thermo公司。

1.3 细胞转染小干扰RNA(siRNA)转染：按照LipofectamineTM3000说明进行siRNA的转染，转染分为阴性siRNA转染组(NC组)及干扰IGF2BP1表达的siRNA组(siRNA1和siRNA2)。siRNA由江苏凯基生物公司设计及合成。简要操作如下：转染前24 h，接种T24细胞(1×105个/孔)于6孔板中，细胞生长融合达到60%时转染siRNA及NC组，siRNA及LipofectamineTM3000分别溶解于Opti-MEM培养基中，制备成siRNA-Lip 3000混合物，转染后于培养箱内孵育1～2 d。

1.4 免疫组化取膀胱组织标本切片,常规脱蜡，抗原提取后，用IGF2BP1抗体(1∶100，Proteintech)封闭并染色，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)代替一抗稀释液作为阴性对照，具体染色实验步骤依据试剂盒进行。结果判定：细胞中出现黄色或棕黄褐色为阳性，阳性细胞比例评分标准为：无阳性计0分、阳性细胞比例<25%计1分、25%～50%计2分、51%～75%计3分、>75%计4分。染色强度评分标准：无染色0分、淡黄色计1分、黄色计2分、棕黄色计3分。以阳性细胞比例评分和染色强度评分之和判断癌组织和癌旁组织中IGF2BP1蛋白的表达，0～4分为阴性，5～7分为阳性。

1.5 RNA提取和qRT-PCRTrizol法(Invitrogen,USA)提取的细胞和组织的总RNA，根据试剂盒说明书利用The Applied Biosystems Stepone Plus PCR System (Applied Biosystems，USA)和LightCycler 480(Roche，USA)仪器进行逆转录及qRT-PCR实验。β-actin用作内参，所有实验重复3次，计算机断层扫描(computed tomography,CT)值取平均值。根据扩增的标准曲线计算出目的基因的CT值后，从而反映IGF2BP1 mRNA的相对表达水平。逆转录及qRT-PCR试剂购自南京诺唯赞公司。PCR引物由南京擎科公司合成，IGF2BP1引物序列:上游TAGTACCAAGAGACCAGACCC，下游GATTTC TGCCCGTTGTTGTC；β-actin引物序列:上游AGC GAGCATCCCCCAAAGTT，下游GGGCACGAAG GCTCATCATT。

1.6 细胞增殖和克隆实验细胞增殖实验中，以每孔1 000个细胞的密度将转染后的细胞接种到96孔板中。接种后24、48、72、96 h分别采用细胞计数kit-8(CCK-8)系统测定细胞活力，用酶标仪(Tecan，瑞士)在450 nm处测定吸光度值。对于克隆形成实验，将500个细胞接种到6孔板中并保持在完全培养基中生长8 d，而后将克隆板在1.44 mol/L多聚甲醛中固定20 min，并用结晶紫染色液(碧云天生物公司)染色20 min后拍摄可见的群落。

1.7 生物信息学分析TCGA数据库中膀胱癌基因表达量数据的收集：在TCGA数据库中下载膀胱癌相关转录谱的基因表达量数据(https://portal.gdc.cancer.gov/),数据类型为HTSeq-FPKM。获得膀胱癌基因表达量数据420例,其中19例癌旁组织，411例肿瘤组织。之后提取19种m6A相关基因的mRNA表达量并进行数据校正，应用R4.0.0软件进行统计学分析及相应图形绘制，采用“heatmap”包进行图形绘制。评估m6A相关蛋白之间的交互关系：使用STRING数据库(http://stringdb.org)进行m6A相关蛋白的相关性分析。

1.8 统计学分析SPSS 26.0软件进行统计学分析，通过t检验或卡方检验分析两组之间的差异，非配对样本间比较采用Wilcoxon秩和检验或Kruskal-Wallis秩和检验。所有统计检验均为双侧，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 m6A相关蛋白在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达水平TCGA数据分析结果显示，在19种m6A相关蛋白中,甲基化蛋白METTL3、阅读蛋白IGF2BP1、IGF2BP3和YTHDC1的表达量在肿瘤组织中显著高于癌旁组织；而其他甲基化蛋白如METTL14和METTL16，去甲基化蛋白ALKBH5和FTO的表达在肿瘤组织中则显著下调(P<0.05，图1A)。同时，在膀胱癌中，m6A相关蛋白之间存在不同程度的相关性。其中IGF2BP1与METTL3、IGF2BP2、IGF2BP3和YTHDC1等呈现不同强度的正相关性(图1B),提示IGF2BP1可能通过m6A依赖的方式与其他m6A相关蛋白协调作用发挥致癌作用。GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)联合GTEx中的正常组织样本和TCGA中的临床样本综合分析显示：IGF2BP1在膀胱肿瘤中高表达(图1C)。

A：19种m6A相关蛋白在TCGA膀胱癌样本中的差异表达;B：STRING数据库分析19种m6A相关蛋白的相关性;C：GEPIA数据库显示IGF2BP1在膀胱癌中的高表达。图1 m6A相关蛋白在膀胱癌中的表达

2.2 IGF2BP1在膀胱癌组织及人膀胱癌细胞系中的表达水平在35例膀胱癌患者的临床样本中，qRT-PCR实验显示膀胱肿瘤组织中IGF2BP1的mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(P=0.048 1,图2A)，与公共数据库TCGA分析结果一致。免疫组化检测表明，IGF2BP1的蛋白表达水平在肿瘤组织中也显著高于癌旁组织(图2B)。随后我们以人正常膀胱上皮细胞SV-HUC细胞为对照组细胞，通过qRT-PCR检测人膀胱癌细胞系中IGF2BP1的mRNA表达水平，结果显示，在T24、J82和TCC细胞株中，IGF2BP1的mRNA表达均明显高于其在SV-HUC细胞中的表达；但在BIU87膀胱癌细胞中，IGF2BP1表达差异不明显(图2C)。BIU87细胞属于低度恶性膀胱癌细胞，而T24、J82和TCC细胞则是高度恶性膀胱癌细胞，IGF2BP1的表达是否与肿瘤的恶性程度相关，有待后续研究验证。

A:qRT-PCR检测35对膀胱癌组织(T)与相邻癌旁组织(N)中IGF2BP1 mRNA的相对表达水平；B:免疫组化检测显示IGF2BP1蛋白在膀胱癌临床样本中的表达情况(×200，×400)；C:以SV-HUC细胞为对照，qRT-PCR检测膀胱癌细胞系中的IGF2BP1的相对表达水平(*P<0.05,**P<0.01，NS表示数据无统计学意义)；D:生存分析显示IGF2BP1表达水平对35例膀胱癌患者预后的影响。图2 IGF2BP1在膀胱癌临床样本中表达升高并影响膀胱癌患者预后

2.3 IGF2BP1表达与膀胱癌患者病理特征的相关性分析在本研究中，IGF2BP1的mRNA表达与膀胱癌患者的年龄、性别、肿瘤分期、分级和肿瘤最大径之间均无明显关联(P>0.05，表1)，可能是本研究中临床样本例数过少导致。但是Kaplan-Meier生存分析显示，与低表达IGF2BP1的膀胱癌患者相比，高表达IGF2BP1的患者预后更差，生存时间更短(P=0.030 2，图2D)。

表1 IGF2BP1 mRNA的表达与膀胱癌患者病理特征的相关性分析

2.4 IGF2BP1 siRNA转染效果及其对膀胱癌细胞增殖能力的影响T24细胞转染IGF2BP1 siRNA 48 h后，通过qRT-PCR和Western blot实验分别检测各组细胞IGF2BP1的表达水平。结果显示，相比于NC组，siRNA组IGF2BP1的表达明显降低(图3A、B)。随后使用转染好的细胞进行细胞增殖实验，CCK8实验检测显示，IGF2BP1基因干扰后导致细胞增殖能力显著下降(图3C)。克隆形成实验检测也显示，IGF2BP1基因干扰降低了菌落形成效率(图3D)。

A～B：qRT-PCR和western blot实验检测IGF2BP1小干扰RNA的转染效率；C～D：CCK8实验和克隆形成实验检测IGF2BP1干扰后膀胱癌细胞的增殖能力。结晶紫染色；*P<0.05,**P<0.01。图3 IGF2BP1干扰后膀胱癌细胞增殖能力减弱

3 讨 论

m6A甲基化蛋白和去甲基化蛋白之间的交互作用决定了m6A修饰的动态过程和可逆调节。然而，m6A修饰必须被不同的阅读蛋白所识别才能发挥不同的下游功能[11]。阅读蛋白IGF2BP1在胚胎发育过程中大量存在，在成年时几乎看不到，但在癌症发生时IGF2BP1又重新合成进而表达上调[12]。既往研究发现IGF2BP1可通过内切酶干扰目标mRNA的降解发挥致癌作用；最近的研究发现IGF2BP1优先识别发生m6A修饰的mRNA，其与靶基因的关联也可以通过识别靶转录本的m6A修饰而增强，表明IGF2BP1是一种新的m6A解读器[8]。2020年最新研究表明，作为m6A修饰的阅读蛋白，IGF2BP1可以通过识别m6A修饰进而缩短多种癌细胞的G1期细胞周期[13]；LINC00266-1编码的多肽RBRP可以增强IGF2BP1对靶基因的m6A修饰的识别，从而发挥致癌功能[7]。

在过去的40多年里，肌肉浸润性膀胱癌和晚期膀胱癌的系统治疗主要以铂类的化疗为主。然而在近10年，测序技术的发展使得膀胱癌的基因组特性得以快速确定，加深了我们对膀胱癌发病机制的理解，膀胱癌治疗前景也相应地发生了一些变化：常用的分子靶点被用于开发靶向疗法，如成纤维细胞生长因子受体抑制剂和抗体-药物偶联疗法[14]。而m6A修饰研究的迅速发展也标志着分子生物学的重大进展，有助于揭示癌症发展的生物学机制，可能为癌症治疗提供新的靶点。目前多项研究表明甲基化蛋白METTL3写入m6A修饰后可以促进膀胱癌进展[10,15-16]；METTL14介导Notch1发生m6A修饰却可以抑制Notch1自身RNA的稳定性，进而抑制膀胱癌干细胞的自我更新与膀胱肿瘤的发生[17]，其他关于m6A修饰在膀胱癌中的研究相对较少。

本研究通过siRNA技术干扰膀胱癌细胞IGF2BP1的表达，结果发现IGF2BP1表达抑制后膀胱癌细胞增殖活力明显降低，提示抑制IGF2BP1表达可减缓膀胱癌的发生发展。同时本研究结果显示，IGF2BP1在膀胱癌组织和膀胱癌细胞中表达均明显上调，与公共数据库TCGA的分析结果一致，提示IGF2BP1的高表达可能与膀胱癌的发生、发展紧密相关，有可能会成为膀胱癌治疗中新的治疗靶点，但是由于本研究临床样本太少，IGF2BP1 mRNA的表达与患者的病理特征均无明显关系，后续还需要大量的临床研究进一步验证。下一步本课题组将重点研究IGF2BP1基因表达影响膀胱癌进展的具体机制，并且探讨针对性靶向基因治疗是否具有临床应用的研究前景。