基于网络药理学和分子对接研究“柴胡-丹参”药对治疗慢性乙型肝炎的作用机制*

任思思，范 妤,△，郭东艳，李 倩，陈 阳，翟秉涛，史晓燕，段丽芳

(1.陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是指检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)为阳性，具有潜伏期长、治愈率低、病情易恶化等特点的一类慢性传染性疾病，被我国法典列入乙类传染病的范畴[1]。中国是世界上感染HBV病毒最多的国家，为了就关于防治肝炎的可持续发展目标采取了一系列的治疗措施，在过去30年里，我国取得了良好的进展，将在2030年前成为全球消除CHB的主要贡献者[2]。但中国作为人口基数大的国家，国内感染HBV病毒的患者高达7 000万左右，中国在实现到2030年消除乙型肝炎的目标方面仍然面临挑战[3]。目前西医对CHB以核苷酸类似物和干扰素两大类为主，但存在无法完全消除或灭活cccDNA，造成疾病停药后易复发等缺点[4]。

CHB根据症状、体征，中医学属于“鼓胀”“黄疸”“肝热病”等肝脏疾病的范畴，并因本病具有广泛的传染性，亦归属“疫邪”的范畴。本病病位在肝，肝胆湿热兼气滞血瘀为本病常见证型，清热利湿、理气化瘀是主要治法[5]。查阅大量文献，对治疗CHB的证型、用药频率、用药规律、归经等进行统计学分析[6-7]，其中柴胡、丹参两味药材在多种证型中为主治药物，选用频次较高，是CHB主治方剂的多用中药。现有研究表明，柴胡中的有效成分具有疏肝理气、解毒除湿、抗病毒、抗肝炎损伤等生物活性[8]。丹参具有抗炎镇痛、活血化瘀、清心除烦、抗纤维化、抗心血管疾病等功效[9]。尽管两药相配伍共奏清热利湿、疏肝理气、养血柔肝之效，但因其中药化学成分复杂，为阐明其治疗CHB的作用机制带来了一定困难。

网络药理学是运用网络数据库和相应软件及算法，借助生物信息学、系统生物学等相关学科理论，对其进行系统性、整体性网络分析的一门新兴学科[10]。本研究采用网络药理学和分子对接的方法，对柴胡-丹参药对治疗CHB数据中的药物及疾病成分、靶点进行多层次、多通路、多角度分析，构建相互靶点作用网络，并对其有效成分与慢性乙型肝炎HBcAg、HBeAg、HBsAg进行分子对接，深入探讨柴胡-丹参药对治疗CHB的潜在作用机制，为以后的实验研究和临床应用奠定了新的思路和理论依据，方案流程图如图1所示。

图1 网络药理学流程图

1 材料与方法

1.1 获取“柴胡-丹参”有效活性成分及靶点筛选 借助 TCMSP 数据库(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)和CNKI(https：//www.cnki.net/)获取中药的有效活性成分。在TCMSP的“Herbname”中分别以“柴胡”“丹参”为关键词进行检索，获取相对应的全部有效化学成分信息。设置条件为口服利用度(oral bioavilability，OB)≥30%，类药性(drug-like，DL)≥0.18，筛选满足口服利用度高且药物相似性较好的有效；成分纳入研究。同时在CNKI中查阅文献和药典，将已有文献报道对治疗疾病的潜在化学成分纳入其中。

利用TCMSP数据库查询化合物的靶点，在U－niprot数据库(https：//www.uniprot.org/)和 Drugbank数据库(http：//www.drugbank.ca/)中查找对应基因，设置物种为“Homo Sapiens”，且校正所有靶点基因名称，删除与标准不符的基因。

运用网络图像化软件 Cytoscape3.7.2(http：//www.cytoscape.org/)将查询到的化合物成分及其作用靶基因构建相关的网络图，其节点大小和颜色深浅与Degree值呈正比关系。

1.2 慢性乙型肝炎靶点的筛选 在OMIM数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)、Drugbank 数 据库(http：//www.drugbank.ca/) 和 GeneCards数据库(http：//www.genecards.org)中，以“chronic hepatitic B”为关键词进行检索，查询到与CHB相关的靶点基因。将得到的基因合并、去重，得到CHB的靶点基因。

1.3 获取“柴胡-丹参”药对与CHB共同靶点及PPI网络的构建 运用 venny 2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将“柴胡-丹参”药对化合物成分中潜在靶点与疾病靶点取交集，得到共同的靶基因。将靶点导入STRING数据库(https：//string-db.org/)，设置物种为“Homo Sapiens”，置信度“highest confidence(0.9)”，获取相对应的PPI网络图，保存TSV格式，应用R语言绘制“柴胡-丹参药对-CHB-靶点柱状图”，可直观反映基因在PPI网络中的连接节点，连接节点的数目越多，代表该基因在药物与疾病中发挥的作用越重要。

1.4 “柴胡-丹参”药对与CHB-有效成分-靶点网络图的构建 通过共同核心靶点反向找到相应的有效成分，删除重复成分，得到共有活性成分。将其导入Cytoscape3.7.1软件绘制相互作用网络，并分析结果，图中节点的大小与度值呈正比关系，获得最终“柴胡-丹参药对与CHB-有效成分-靶点图”。

1.5 靶点富集通路分析及可视化处理 为了阐明“柴胡—丹参”药对靶点蛋白的基因功能以及中药化合物对于治疗CHB的潜在作用靶点在信号通路中的具体作用，应用R语言中的ClusterProfiler对核心靶点进行GO分析和KEGG通路分析，并对富集分析结果进行可视化处理，以及GO功能和KEGG代谢通路图作具体分析。

1.6 核心有效成分与慢性乙型肝炎HBcAg、HBeAg、HBsAg分子对接 HBV是一个小的圆形的部分双链、有包膜的脱氧核糖核酸病毒，属嗜肝DNA病毒科，包括核心抗原(HBcAg)、包膜抗原(HBeAg)和表面抗原(HBsAg)。这3种抗原存在于基因组中的编码蛋白，也是导致和维持CHB在病毒与宿主细胞结合中发挥免疫耐受的重要原因之一[11]。故将HBsAg、HBcAg、HBeAg作为CHB的主要基因蛋白，在PDB(http：//www.rcsb.org/)数据库中找到对应的蛋白结构。从1.4的条件中找到度值最高的有效成分，在Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中找到其相对应的2D结构，导入chem3D 16.0软件对结构优化转为mol2结构。将蛋白与小分子结构导入Autodocks 4.2.6软件中进行相互作用，在cmd中运用vina系统得到有效成分与靶蛋白的结合能，在Pymol软件中对其可视化处理。

2 结果与分析

2.1 “柴胡-丹参”药对主要活性成分 使用TCMSP数据库在1.1的条件下，筛选出符合条件的化合物成分柴胡17个，丹参65个，查阅相关文献[12]发现丹参中丹参素(danshensu)、丹酚酸A(salvianolic acid A)不在其中，可能因不符筛选OB值与DL值的条件被系统删除，但考虑在治疗疾病中发挥积极作用，故纳入这2个化合物。然后在TCMSP数据库进行靶点检索，部分化合物未匹配到相对应的靶点蛋白，将其删除，共得到“柴胡-丹参”有效成分73个。如表1所示，为便构建网络分析图，有效成分由简字母代替，如表1。

表1 “柴胡-丹参”有效成分汇总

续表1

续表1

2.2 药对活性成分对应的靶点及网络分析 在U－niprot和Drugbank数据库中，设置物种为“Homo Sapiens”，将“柴胡-丹参”药对中有效蛋白靶点转化为对应基因名，删除重复靶点，共得到239个靶基因。使用Cytoscape3.7.1绘制“柴胡-丹参药对有效成分-靶点”网络图，如图2所示，图中包含316个节点和1343条边，其节点大小、颜色深浅与Degree值呈正比关系。从图中可以看出柴胡-丹参药对中的有效成分能够与多个靶点相关联，而某些靶点又可作用于多个有效成分，从而反映出该药对多靶点、多成分特。

图2 柴胡-丹参药对有效成分-靶点

2.3 疾病对应的靶点 分别在OMIM数据库、Drugbank数据库和GeneCards数据库取中位数获得与CHB密切相关的基因靶点，将3个数据库的基因合并去重得到985个。

2.4 中药-疾病核心靶点与PPI网络图分析 应用venny 2.1将柴胡-丹参化合物成分中潜在靶点与CHB靶点进行匹配，得到“柴胡-丹参”药对与CHB交集靶点韦恩图，如图3所示，图中柴胡-丹参药对和CHB三者共同交集靶点48个，“柴胡-丹参”药对与CHB交集靶点88个。

图3 “柴胡-丹参”药对-CHB-靶点韦恩图

将共有的88个靶点导入string数据库中获取相对应的PPI网络图，保存为TSV结构，应用R语言筛选前30个靶点绘制“柴胡-丹参药对-CHB-靶点柱状图”，如图4所示。根据数值筛选前10的靶点分别是：STAT3、JUN、TP53、AKT1、TNF、RELA、MAPK1、IL6、MAPK14、MAPK8，表明柴胡-丹参药对治疗CHB中这些核心靶点发挥了重要意义。

图4 “柴胡-丹参”药对-CHB-靶点柱状图

在HBV感染中，信号转导和转录激活因子3[13-14](signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通过调节细胞介导因子HBV增强反应以及影响肝脏生长因子和表皮生长因子在CD-95介导细胞凋亡和T细胞毒性的细胞保护作用，参与抑制HBV和肝脏疾病的免疫反应；STAT3也被证明在HBV感染相关的急慢性肝衰竭中使得Th17反应增强[15]。转录因子AP-1[16](transcription factor AP-1，JUN)被激活后可促进细胞迁移，参与细胞内HBV感染和转移。细胞肿瘤抗原P53(cellular tumor antigen p53，TP53)、钾通道 AKT1(potassium channel AKT1，AKT1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)均参与CHB病变进展过程。

2.5 中药疾病共同有效成分及靶点网络图分析 通过共同靶点找到67个有效成分，将其导入Cytoscape 3.7.1软件构建“柴胡-丹参药对-CHB-有效成分-靶点图”。如图5所示，得到的网络图中包含159个节点和527条边，图中节点的大小与Degree值呈正比，节点在网络中作用越强，其Degree值越大。图中粉色正方形为丹参有效成分，肉粉色为柴胡有效成分，绿色六边形为交集靶点，黄色箭头表示中药，蓝色圆形表示CHB，可以看出靶点间相互联系的关系，可以看出柴胡-丹参药对通过多靶点、多成分之间的相互作用共同治疗CHB。

图5 柴胡-丹参药对-CHB-有效成分-靶点图

2.6 GO功能和KEGG代谢分析及可视化结果 借助R软件中ClusterProfiler包，对柴胡-丹参药对治疗CHB的88个共同靶点进行GO功能和KEGG代谢分析，设置P≤0.05，筛选前20个在治疗疾病中发挥显著作用的通路进行可视化处理，得到GO分析气泡图，如图6所示。从图中可以看出，在柴胡-丹参药对治疗慢性乙型肝炎的GO功能分析中，包括细胞因子受体结合(cytokine recept binding)、受体配体活动(receptor ligand activity)、信号受体激活器的活性(signaling receptor activator activity)、细胞因子活性(cytokine activity)、DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)等生物过程。

图6 共同潜在靶点的GO功能富集分析

柴胡-丹参药对治疗CHB的KEGG代谢通路，筛选前20条通路进行可视化处理，得到KEGG分析气泡图，如图7所示。从图中可以看出，柴胡-丹参药对有多重通路可能与CHB有关，主要包括乙型肝炎通路(hepatitis B)、P13k-akt信号通路(P13k-akt signaling pathway)、人类巨细胞病毒感染通路(human cytomegalovirus infection)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、Epstein-Barr病毒感染通路(epstein-Barr virus infection)、在糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等信号通路。

图7 共同潜在靶点的KEGG通路富集分析

2.7 代谢通路图分析 观察图6可知，乙型肝炎通路与P13k-akt信号通路在所有通路中P值最高，与CHB联系最为紧密，在1.5的条件下，借助R软件绘制KEGG代谢通路图，如图8、图9所示。从图8可知，柴胡-丹参药物成分能够调控乙型肝炎通路中多种蛋白的表达，减缓HBV病程的进展。促进MMP-9、Bcl2表达参与肝细胞侵袭转移和抗凋亡；对STAT、STAT3磷酸化后，作用于胞核，参与肝细胞增殖；可通过激活IL-8促进HCC发展；可调控c-Myc、STAT3基因等途径参与细胞增殖和分化。从图9可知，有效成分在P13k-akt信号通路中通过多途径控制细胞分化以及调节与其他通路的连接。通路中AKT对于p21磷酸化，从而抑制CDK和Cyclin控制细胞的周期；可抑制Bcl-xL和Bcl-2促进细胞凋亡；可诱导PRK磷酸化等途径参与细胞增殖和修复DNA。P13kakt信号通路被认为是肝癌侵袭转移的诊断和预后指标，也是治疗肝癌的靶点[17]。

图8 乙型肝炎通路图

图9 P13k-akt信号通路图

2.8 中药核心成分与疾病靶蛋白分子对接结果分析 现代医学研究表明，配体与受体结合的结合能与活性呈反比，结合能越低其活性越好，药物治疗疾病的作用可能越大。根据图4的Degree值筛选度值最大的有效成分别为槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)，将其与CHB中靶蛋白HBcAg、HBeAg、HBsAg进行对接，结果见表2，可知槲皮素、木樨草素与HBcAg、HBeAg、HBsAg靶蛋白的结合能数值较小，具有较好的亲和力。

表2 有效成分与靶蛋白对接结果

其对接构像，如图10所示，具有较好的结合活性，分子的构像比较稳定。表明有效活性成分可以抑制HBV，阻断其与宿主细胞的相互作用，因此，“柴胡-丹参”药对治疗CHB具有潜在的作用机制。

图10 槲皮素、木樨草素与靶蛋白HBcAg、HBeAg、HBsAg的对接构像

3 讨论

CHB治疗的主要方案是抑制HBV复制以及提高人体免疫能力，该疾病治疗的主要目标是阻止疾病进展，从而防止发展为肝纤维化和肝癌来提高存活率和生活质量[18]。中医治疗疾病采用辨证论治的基本方法，认为CHB主要与人体正气亏虚及外感湿热疫毒侵袭有关，病理产物湿热贯穿于整个疾病阶段；同时本病长期代谢的病理产物淤血，是影响着CHB病情发展变化的重要因素，故常使用清热利湿解毒、活血祛瘀药物。查阅CHB用药规律分析文献显示[6-7]，治疗CHB各证型的常用方剂中，均引入柴胡-丹参药对，选用频率较高；柴胡-丹参药对相配伍共奏疏肝理气、清热利湿、养血柔肝之效[19]。

网络药理学分析后显示，“柴胡-丹参”药对治疗CHB发挥作用的有效活性成分73个，对应的潜在靶点985个。经柴胡-丹参药对-CHB-有效成分-靶点图网络筛选后159个节点，527条边，体现出本药对的化学成分与靶点间具有复杂的相互作用；分析Degree值，得到药对治疗CHB的核心靶点88个，其中主要包括 PTGS2、ADRB2、HSP90AA1、ESR1、PPARG等。有文献报道表明[20]，PTGS2能够通过介质对HBV产生抑制作用，参与病毒表达和转录过程。ADRB2在小细胞富集的转录簇中表达，其表达的高低与神经内分泌分化程度有关，并与缩短病人生存周期有关[21]。HSP90AA1属于热蛋白家族，在肝细胞癌变和病毒活性下进行差异表达，作用于该位点，可有效阻断病情进一步恶化[22]。

临床实验研究表明[23-25]，柴胡调节机体的巨噬细胞，不影响细胞活性但刺激细胞代谢MTT和积累NR的能力，抑制炎性因子的生成，表明细胞的免疫功能增强和发挥抗炎作用；同时柴胡成分直接参与了与α-对苯二甲酸类似的活性氧引起的氧化细胞过程，减少肝损伤程度。丹参中的有效成分可以激活酶的活性，抑制病毒在细胞增殖、侵袭、转移，减少肝脏的病理损伤，延缓疾病进展以及提高机体免疫能力[26-27]。

通过GO功能分析和KEGG代谢富集通路对共同88个靶点分析，显示生物过程包括细胞因子受体结合(cytokine recept binding)、受体配体活动(receptor ligand activity)、信号受体激活器的活性(signaling receptor activator activity)等，抑制了病毒与宿主细胞表面受体相结合、抑制细胞间复制、阻断信号传递、抑制病毒活性等生物活性。信号通路包括乙型肝炎通路(hepatitis B)、P13k-akt信号通路(P13k-akt signaling pathway)、人类巨细胞病毒感染通路(human cytomegalovirus infection)等，在细胞生长、增殖及凋亡中起关键作用。其中柴胡-丹参药物成分能够调控乙型肝炎通路中多种蛋白的表达，参与肝细胞增殖、侵袭、转移等过程，减缓HBV病程的进展。P13k-akt信号通路是调控细胞信号传导过程的重要通路，参与乳腺癌、膀胱癌和非小细胞肺癌的进展[17]。通路中PI3K可以激活蛋白激酶AKT，促进细胞的生长和增殖，PTEN和活化的AKT与肝内转移、肿瘤分级和高增殖指数相关，通过多种途径参与代谢、凋亡、细胞生长和增殖，P13k-akt的表达与疾病临床分期呈正相关，表明该通路可抑制病毒复制、细胞周期进程、迁移和侵袭降低[28]。

HBV与肝细胞表面受体结合，入侵细胞后通过复制引起免疫应答，导致细胞损伤、炎症进而导致坏死[29]。血清中大量存在的HBsAg是导致免疫耐受的主要原因，能够反应患者清除HBV的情况，也是临床上判断CHB得到控制的重要指标之一[30]。HBcAg与HBeAg都是HBV复制过程中同步产生的翻译蛋白，将其作为观察HBV复制的指标。HBcAg是HBV内衣壳的成分之一，经过内源性抗体途径在肝细胞表面表达，参与免疫反应，进一步造成肝损伤[31]。HBeAg在细胞内加工后，分泌至胞外，能够在血清中检测，并且血清学表达阳性与患者停药后复发率相关[32-33]。HBV基因组中的编码蛋白HBsAg、HBcAg、HBeAg，参与患者病毒学应答和疾病预后，也是导致和维持CHB在感染过程中免疫耐受的重要原因[34]。其中，故将HBsAg、HBcAg、HBeAg作为CHB的主要基因蛋白，根据图4度值筛选有效活性成分槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)与CHB中靶蛋白HBcAg、HBeAg、HBsAg分子对接，结合能数值较小，则亲和力较好。有效成分与病毒表面抗原结合，能够减少HBV对肝细胞的吸附，并且抑制HBcAg、HBeAg、HBsAg的分泌，减少患者的耐药性、抗病毒效应[35-36]。槲皮素是一种分布广泛的植物黄酮醇，据报道对脑膜炎病毒、HSV、HIV、副流感病毒3型、伪狂犬病病毒具有体外抗病毒活性，体外实验表明[37]槲皮素具有较高的抗HBV潜力。

本研究运用网络药理学和分子对接相结合的方法，预测了“柴胡-丹参”药对治疗CHB的有效蛋白成分、关键靶点和生物活性通路，阐明了其抑制肝纤维化、抑制病毒活性、减少肝损伤、提高免疫力等作用机制，具有一定的预测性和准确性，后续还可以通过在体、离体实验研究获得更可靠的实验依据。