水牛Novel-miR-57对Bcap-37和BMECs细胞DOK4基因的调控作用

蔡小艳 李雅辉 鲍正潘 陈秋萍 李胜 周宇 邓凯 石德顺 刘庆友

摘要：【目的】篩选Novel-miR-57调控靶基因，并明确其对靶基因的调控作用及生物功能，为揭示水牛乳腺上皮细胞（BMECs）的分化机理提供科学依据。【方法】利用MiRscan预测Novel-miR-57二级结构;以自编软件Ensembl（v80）注释的水牛mRNA截取3'-非翻译区（3'-UTR）作为预测数据库，采用Miranda（v3.3a）对Novel-miR-57进行靶基因预测;运用实时荧光定量PCR筛选重点靶基因。以化学合成的Novel-miR-57模拟物Mimics和抑制剂Inhibitor，分别转染人类乳腺癌细胞（Bcap-37）及BMECs细胞，以验证Novel-miR-57与靶基因的表达相关性。【结果】Novel-miR-57前体序列形成7个茎环结构，成熟序列位于第1、2和3个茎环结构间，其结合自由能为-53.70 kcal/mol。以结合自由能低于-20.00 kcal/mol为标准，最终筛选出34个可能的靶基因，共与42条KEGG信号通路存在关联，其富集的信号通路主要有代谢通路（ID：bta01100）、PI3K-Akt（信号通路（ID：bta04151）、MAPK信号通路（ID：bta04010）和细胞因子—细胞因子受体相互作用（ID：bta04060）等;经实时荧光定量PCR检测分析发现DLX3、CANCNG3、DOK4、NFKBID、C17orf53、RTN1和FBXO10等7个靶基因在非泌乳期的相对表达量极显著高于泌乳期（P<0.01），二者间相差100.0倍以上，且与Novel-miR-57的相对表达量呈负相关。7个靶基因中仅DOK4基因与Novel-miR-57的表达具相关性，以200 nmol/L Inhibitor转染B-cap37细胞能显著提高DOK4基因表达（P<0.05，下同），添加100 nmol/L Mimics则显著抑制DOK4基因表达。以100 nmol/L Mimics转染BMECs细胞，Novel-miR-57和DOK4基因的相对表达量显著提高;而以200 nmol/L Inhibitor转染BMECs细胞，Novel-miR-57和DOK4基因的表达均受到显著抑制。【结论】Novel-miR-57含有7个茎环结构，且其成熟序列位于第1～3个茎环上。Novel-miR-57过表达可下调Bcap-37细胞DOK4基因表达或上调BMECs细胞DOK4基因表达，即Novel-miR-57对靶基因的调控作用因乳腺细胞生理状态不同而存在差异。

关键词： 水牛;Novel-miR-57;靶基因;BMECs细胞;Bcap-37细胞;调控作用

中图分类号： S823.83                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）02-0269-11

Abstract：【Objective】In order to provide scientific basis for revealing the differentiation mechanism of buffalo mammary epithelial cells（BMECs）， the regulatory target gene of Novel-miR-57 was screened to clarify its regulatory function and biological function on target genes. 【Method】MiRscan was used to predict the secondary structure of Novel-miR-57. The target gene of Novel-miR-57 was predicted by Miranda（v3.3a） using buffalo mRNA truncated 3-untranslated region （3'-UTR） annotated by Ensembl（v80） as prediction database. Key target genes were screened by real-time fluorescence quantitative PCR. To verify the correlation between Novel-miR-57 and target gene expression， chemically synthesized mimics and inhibitor were transfected into human breast cancer cells（Bcap-37） and BMECs cells， respectively. 【Result】The precursor sequence of Novel-miR-57 formed seven stem-loops， and the mature sequence was located between the first， second and third stem-loops， and its binding free energy was -53.70 kcal/mol. With the binding free energy lower than -20.00 kcal/mol as the standard， 34 possible target genes were finally screened out， which were associated with 42 KEGG signaling pathways. The enriched signaling pathways mainly included metabolic pathway（ID：bta01100）， PI3K-Akt（ID：bta04151）， MAPK signaling pathway（ID：bta04010） and cytokine-cytokine receptor interaction （ID：bta04060）. The real-time fluorescence quantitative PCR showed that the relative expression of seven target genes，DLX3， CANCNG3， DOK4， NFKBID， C17orf53， RTN1 and FBXO10， were significantly higher in non-lactation period than in lactation pe-riod（P<0.01）， and the difference between them was more than 100.0 times， which were negatively correlated with the relative expression of Novel-miR-57. Only the expression of DOK4 gene was correlated with the expression of Novel-miR-57 among the seven target genes. Transfection of B-cap37 cells with 200 nmol/L inhibitor could significantly increase the expression of DOK4 gene（P<0.05， the same below）， while addition of 100 nmol/L mimics could significantly inhibit the expression of DOK4 gene. The relative expression of Novel-miR-57 and DOK4 gene was significantly increased when BMECs cells were transfected with 100 nmol/L mimics. The expression of Novel-miR-57 and DOK4 gene were significantly inhibited when BMECs cells were transfected with 200 nmol/L inhibitor. 【Conclusion】Novel-miR-57 contains se-ven stem-loops， and its mature sequence locates on the first to the third stem rings. Overexpression of Novel-miR-57 can down-regulate DOK4 gene expression in Bcap-37 cells or up-regulate DOK4 gene expression in BMECs cells， that is， Novel-miR-57 has different regulating effects on target genes due to different physiological states of breast cells.

Key words： buffalo; Novel-miR-57; target gene; BMECs cell; Bcap-37 cell; regulating effects

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960680）; Ningxia Key Research and Development Project（2018BEB04031）

0 引言

【研究意义】microRNAs（miRs）是一类约22 bp的非编码小分子RNA，大量存在于哺乳动物体内（李新云等，2017）。miRs通过与靶mRNA分子的3'-非翻译区（3'-UTR）不完全结合以抑制或降解mRNA翻译（Stark et al.，2005），进而调控细胞的发育、分化及增殖等重要生命活动过程（王塑天等，2013;Jiao et al.，2019）。miRs還参与乳腺发育，包括维持乳腺上皮前体细胞、促使乳腺上皮管道长出及促进乳腺上皮细胞增殖分化等（Wang et al.，2018）。因此，研究miRs对乳腺细胞基因的调控作用及其功能，可为揭示乳腺泌乳机制和提高泌乳性能奠定基础。【前人研究进展】目前，有关miRs的研究主要集中在功能调控和作用机理等方面，如miR-103通过靶向PANK3（Pantothenate kinase 3）调控水牛乳脂代谢（蔡小艳，2016）;miR-200b通过负调控靶基因Pten（Phosphatase and tensin homologue）表达而正调控奶牛乳腺泌乳（边艳杰等，2018）;miR-183通过靶向MST1（Mammalian sterile 20-like kinase 1）基因来调节山羊奶中脂肪的消化吸收、合成及分解（Chen et al.，2018）;miR-3880通过与奶山羊乳腺上皮细胞OGR1（Ovarian cancer G protein-coupled receptor 1）基因3'-UTR结合而调控其mRNA和蛋白的表达（侯金星等，2019）;miR-4312通过靶向PDCD4（Programmed cell death protein 4）以促进细胞增殖和抑制细胞凋亡（苑红，2019）;miR-221通过靶向STAT5a（Signal transducer and activator of transcription 5A）和IRS1（Recombinant insulin receptor substrate 1）基因调控牛乳腺上皮细胞增殖（Jiao et al.，2019）;miR-92a具有调控奶山羊乳腺发育和泌乳性能的潜能（包黎娟等，2020）;miR-28-3p能促进三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468（人乳腺癌细胞）的增殖、侵袭和抑制其凋亡（李杰等，2020）;miR-380-5p能抑制乳腺癌细胞增殖和促进乳腺癌细胞凋亡（孙云菊等，2020）。此外，有少数学者针对测序新发现miRs的靶基因及其功能进行研究。崔晓钢等（2015）基于物种间序列同源比对新发现44条牛候选miRs，选取其中4条进行实时荧光定量PCR验证，并预测对应的靶基因，但尚未进一步研究其调控功能。郭丽霞（2017）基于高通量技术从5头黄牛和5头水牛的大脑组织中测序获得Novel-miR-25和Novel-miR-13，并证实二者均能调控大脑功能及神经元的分化和发育。臧树成等（2018）研究发现，处于冷应激状态下大鼠肝脏中的Novel-miR-133-5p异常上调，可能对机体的生长发育、免疫调节及遗传等有重要影响。练雨（2019）对经脂多糖（LPS）处理的猪子宫内膜上皮进行测序，结果发现Novel-mir-106-5p能抑制NF-tB激活，降低NF-tB磷酸化水平。Li等（2020）从96 条日本牙鲆miRs中筛选出pol-miR-novel-171，并证实其靶向负调控FAM49B（Family with sequence similarity 49，member B）的3'-UTR。张月（2020）研究表明，奶山羊乳腺中的Novel-miR-3880可通过PI3K/AKT/mTOR/S6Kl和Bcl-2/Bax通路调节乳腺上皮细胞细胞生长、乳脂合成和乳酪蛋白分泌，进而促进乳腺发育。【本研究切入点】尽管目前已有较多关于miRs调控牛和水牛乳腺基因表达的研究，但针对水牛乳腺组织新发现miRs的调控基因研究鲜见报道。本课题组前期基于Solexa高通量测序和实时荧光定量PCR，在创建的miRs文库中发现并鉴定出5个新的水牛miRs表达模式（蔡小艳等，2017a，2017b），其中Novel-miR-57在水牛泌乳期和非泌乳期的表达量差异极显著，是5个新发现水牛miRs中差异最明显的miRs（Cai et al.，2017），因此深入研究Novel-miR-57对揭示水牛乳腺细胞的泌乳作用机制具有重要意义。【拟解决的关键问题】通过MiRscan预测Novel-miR-57二级结构，以化学合成的Novel-miR-57模拟物Mimics和抑制剂Inhibitor分别转染人类乳腺癌细胞（Bcap-37）及水牛乳腺上皮细胞（BMECs），筛选其调控靶基因，并明确Novel-miR-57对靶基因的调控作用及生物功能，以期为揭示BMECs细胞的分化机理提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

水牛乳腺组织采自广西南宁市屠宰场，一般于凌晨2：00—4：00时采集;泌乳期样本为可明显观察到有白色乳液一直流出的乳腺组织，非泌乳期样本是无法从表面上看出有白色乳液流出，且用手按压后也无乳液流出的乳腺组织。2种乳腺组织样本各3个重复，以生理盐水清洗干净后，立即使用消毒眼科手术剪在所有样本的组织内部取样1.0～2.0 g，装入2 mL的EP管中，然后立即将其放进液氮罐，带回实验室置于-80 ℃冰箱保存。BMECs细胞为亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室分离获得;Bcap-37细胞由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存提供。DMEM培养基、FBS和Lipo2000转染试剂购自Life Technology公司;一步快速反转试剂盒购自TaKaRa公司;荧光定量SYBR Green Master和Mix罗氏转染试剂购自瑞士Roche公司。仪器设备主要有CO2培养箱（Thermo公司）、低温离心机（Beckman公司）及荧光定量PCR仪等（蔡小艳等，2016）。

1. 2 Novel-miR-57二级结构预测

登录MiRscan（http：//genes.mit.edu/mirscan/），输入Novel-miR-57基因序列，单击Submit即可获得结果（刘长征和余佳，2012;王伟等，2019）。

1. 3 引物设计与合成

采用Primer 3.0进行PCR扩增引物设计，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Novel-miR-57的茎环反转录引物为5'-GTCGTATCCAGTG CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGGTC-3'，U6的逆转录引物为5'-CGCTTCACGA ATTTGCGTGTCAT-3';Novel-miR-57的实时荧光定量PCR上游引物为5'-GGAAATACCGGCACGAGA C-3'，下游引物为5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';内参基因U6的实时荧光定量PCR上游引物为5'-CTC GCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3'。Novel-miR-57预测靶基因的实时荧光定量PCR扩增引物见表1。

1. 4 实时荧光定量PCR

参照蔡小艳等（2016）的方法，将0.1 g乳腺组织置于研钵中，倒入液氮迅速研磨，加入TRIzol试剂进行总RNA提取;提取获得的总RNA采用紫外分光光度计测定其浓度，并以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。使用AMV试剂盒（TaKaRa）反转合成cDNA：反应液配制均在冰上操作，依照AMV试剂盒说明加入各种试剂进行反转录。将反转录合成的cDNA稀释至100 ng/mL，实时荧光定量PCR反应体系20.0 μL： cDNA模板1.0 μL，SYBR GreenMaster 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，无RNA酶水8.4 μL。扩增程序：95 ℃预变性10 min;95 ℃ 15 s，60～55 ℃ 1 min，进行40个循环，收集荧光。每个样品设3个重复，以U6基因为Novel-miR-57的内参基因。

1. 5 靶基因预测

因水牛全基因组尚未公布，故以Ensembl（v80）注释的水牛mRNA截取3'-UTR作为预测数据库，采用Miranda（v3.3a）对Novel-miR-57进行靶基因预测，筛选出结合自由能小于-20 kcal/mol的3'-UTR，即获得有关Novel-miR-57靶基因总数。

1. 6 化学合成Novel-miR-57的Mimics和Inhibitor转染Bcap-37细胞和BMECs细胞Novel-miR-57 Pri序列为：CACTCAGAGATAA GAGGCTGGGTTCGACTGGGAGAGGATGCAAGTTTCAGGCTAAATACCGGCACGAGACCGATAGTCAACAAGTACCATAAGGGAAAGTTGAAAAGAACTTTGAGATGGTACGTGTGCATGCTAGAGGAACCGTTGCTGTATTAATGAAAGGGCACCTGGCACGTGGAAACACCCCTAAGATGTTCATT。

根据其成熟序列化学合成Novel-miR-57的Mi-mics（正义链：5'-AAAUACCGGCACGAGACCGA-3'，反义链：5'-UCGGUCUCGUGCCGGUAUUU-3'）和Inhibitor（5'-UCGGUCUCGUGCCGGUAUUU-3'），以及Mimics对照（MNC）序列（正义链：5'-UUUGUA CUACACAAAAGUACUG-3'，反义链：5'-CAGUAC UUUUGUGUAGUACAAA-3'）和Inhibitor对照（INC）序列（5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3'）。参照Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）试剂说明转染Bcap-37细胞和BMECs细胞。于直径60 mm的Bcap-37细胞培养皿中分别加入50、75和100 nmol/L Mimics及200 nmol/L Inhibitor，并设空白对照组（NC）;根据Bcap-37细胞的转染结果，分别以100 nmol/L Mimics和200 nmol/L Inhibitor转染BMECs细胞，采用实时荧光定量PCR检测Novel-miR-57和靶基因的表达情况。

1. 7 统计分析

实时荧光定量PCR检测结果采用2-△△Ct法进行换算，然后以SPSS 19.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 Novel-miR-57二级结构预测结果

前体茎环结构是miRNA的主要特征之一，且miRNA的二级结构会影响其加工及成熟miRNA进入不同AGO（Argonaute）蛋白质，因此本研究通过MiRscan对Novel-miR-57的二级结构进行预测分析，结果如图1所示。Novel-miR-57前体序列（黑色）形成7个不一样的小茎环，其成熟序列位于第1、2和3个茎环间的核苷酸序列（红色）上。Novel-miR-57的结合自由能为-53.70 kcal/mol。

2. 2 Novel-miR-57靶基因预测结果

miRNA主要通过结合与调控靶基因实现其生理功能，故使用Miranda（v3.3a）预测Novel-miR-57的靶基因，挑选出结合自由能低于-20.00 kcal/mol的所有靶基因，最终筛选出34个可能的靶基因（表2），经基因资料搜索及信号通路分析，然后筛选部分代表靶基因进行实时荧光定量PCR检测分析。

2. 3 Novel-miR-57靶基因的GO功能注釋及KEGG信号通路富集分析结果

使用GO数据库比对分析Novel-miR-57靶基因，最终获得729个相关类别（Term），其中有89个类别的P<0.05，有2个类别的P<0.01，分别是水解酶活性和线性酰胺中碳—氮键（非缩氨酸）（GO：0016811）及细胞内信号转导负调控（GO：1902532）。将预测筛选获得的34个靶基因输入KEGG数据库，进行系统的KEGG信号通路富集分析，结果发现这些靶基因与42条KEGG信号通路存在关联，其富集的信号通路主要有代谢通路（Metabolic pathways，ID：bta01100）、PI3K-Akt（磷脂酰肌醇三激酶—蛋白激酶B或PKB）信号通路（ID：bta04151）、MAPK（Mitogen-activated protein kinase）信号通路（ID：bta04010）和细胞因子—细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction，ID：bta04060）等。

2. 4 靶基因的实时荧光定量PCR检测分析结果

针对34个预测靶基因进行实时荧光定量PCR检测分析，结果发现在所有乳腺组织中有5个靶基因的相对表达量较低。对比各靶基因在泌乳期和非泌乳期的相对表达量，发现有11个靶基因（图2）在泌乳期的相对表达量相当或显著高于非泌乳期（P<0.05，下同），有10个靶基因（图3）在非泌乳期的相对表达量相当或显著高于泌乳期;而DLX3（Distal-less homeobox 3）、CACNG3（Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 3）、DOK4（Downstream of tyrosine kinase/docking protein）、NFKBID（NFKB inhibitor delt）、C17Orf53（Chromosome 17 open reading frame 53）、RTN1（Isoform RTN1-C）和FBXO10（F-box protein 10）等7个靶基因（图4）在非泌乳期的相对表达量极显著高于泌乳期（P<0.01），二者间相差100.0倍以上，且与Novel-miR-57的相对表达量呈负相关，故将其列为靶向基因的重点筛选对象。

2. 5 靶基因在Bcap-37细胞上的验证结果

实时荧光定量PCR检测结果（图5）表明，仅DOK4基因与Novel-miR-57的表达具相关性，添加Novel-miR-57的Inhibitor能显著提高DOK4基因表达，加入100 nmol/L Mimics则显著抑制DOK4基因表达。

2. 6 转染Mimics和Inhibitor对BMECs细胞Novel-miR-57表达的影响

由图6可知，以100 nmol/L Mimics转染BMECs细胞，Novel-miR-57的相当表达量显著高于其对照组（MNC）;而添加200 nmol/L Inhibitor后Novel-miR-57的相对表达量显著低于其对照组（INC），说明Novel-miR-57转染成功，达到预期效果。

2. 7 转染Mimics和Inhibitor对BMECs细胞DOK4基因表达的影响

由图7可知，以100 nmol/L Mimics转染BMECs细胞，DOK4基因的相对表达量显著提高;而以200 nmol/L Inhibitor转染BMECs细胞，DOK4基因的表达受到显著抑制。综合转染Mimics和Inhibitor对BMECs细胞Novel-miR-57表达的影响可知，Novel-miR-57在BMECs细胞中对DOK4基因表达呈正调控作用。

3 讨论

miRs对乳腺组织起重要的调控作用，可影响乳腺发育，包括维持乳腺上皮前体细胞、促使乳腺上皮管道长出及促进乳腺上皮细胞增殖分化等（Wang et al.，2018;Zheng et al.，2019），其相关研究主要集中在已知miRs的靶向基因挖掘及其功能探析等方面，如miR-27a通过靶向PPAR-γ（Peroxisome proliferato-ractivated receptor gamma）调控甘油三酰合成（Tang et al.，2017），miR-146通过靶向TRAF6（TNF receptor associated factor 6）和HMG（High mobility group）调控乳腺上皮细胞炎症因子（Wang et al.，2017），miR-454通过靶向PPAR-γ调控牛乳腺上皮细胞甘油三酯合成（Zhang et al.，2018）。崔晓钢等（2015）虽然从新发现的44条牛候选miRs中选取4条进行实时荧光定量PCR验证，并预测对应的靶基因，但尚未深入研究靶基因的功能。Novel-miR-57是本课题组从水牛体内新发现的miRs，在水牛泌乳期和非泌乳期的表达量差异极显著，在其功能研究过程中尚存在诸多未知问题和难题。一是Novel-miR-57二级结构尚属于预测阶段，无法确定其二级结构是否会影响miRs加工及成熟miRs进入不同的AGO蛋白质（张伟等，2020）;二是在预测Novel-miR-57靶基因时，由于水牛全基因组尚未公布，因此只能使用自编软件Ensembl（v80）注释的水牛mRNA截取3'-UTR作为预测数据库，而导致靶基因预测数量相对较少;三是验证Novel-miR-57靶基因时由于缺乏相关的参考资料，只能将已筛选出的34个靶基因全部进行实时荧光定量PCR检测分析，最后在细胞水平仅发现DOK4基因与Novel-miR-57存在表达相关性，而以往的研究发现单个miRs可调控多个靶基因表达（吴宁昭，2017;袁茂等，2019），因此對于Novel-miR-57的靶基因及功能作用尚有待进一步研究。

本研究结果表明，仅DOK4基因与Novel-miR-57的表达具相关性，且Novel-miR-57在BMECs细胞中对DOK4基因表达呈正调控作用，即Novel-miR-57的靶基因是DOK4基因。DOK4为酪氨酸激酶下游分子（Win et al.，2018），是细胞膜中的适配器及支架蛋白的组成成分，由15406个氨基酸残基组成，定位于反义链上，同时是胰岛素受体底物（Cai et al.，2003;Hooker et al.，2012），涉及多个信号通路，包括GDNF-家族配体和受体互作等。已有学者在灵长类动物和牛的乳腺细胞中预测到DOK4b基因，被视为酪氨酸激酶发送信号的抑制剂（Zhang et al.，2020）。此外，DOK4的mRNA和蛋白大量存在于多种上皮细胞中，对上皮细胞的分化有一定影响，由此推测DOK4基因受Novel-miR-57表达调控，进而影响上皮细胞分化。DOK4还可能与下游效应分子一起作用，然后与Ret（RET proto-oncogene）的1062Tyr结合，且Shc（Generic shell script compiler）及其他效应器分子也会竞争性与Ret的1062Tyr结合，并根据细胞环境不同而改变对Elk/Elk-1的激活作用。在Caco-2细胞系中，DOK4基因的作用是防止Ret介导的Elk-1信号通路被激活，但该作用在293T细胞中较弱（Grimm et al.，2001;Itoh et al.，2005;Guittard et al.，2018），具体作用机制还需进一步探究。

大部分动物的miRs与靶基因结合后会下调基因表达（汪劼，2016），但在近年来的相关报道中发现动物miRs呈正调控或去抑制作用，即在少数动物中miRs能促进靶基因上调表达。Vasudevan等（2007）研究发现，miRs既可降低靶基因表达，又能促使靶基因执行活化功能。当细胞处于休眠期时，miRs能上调基因表达;当细胞处于循环/增殖期时，miRs则抑制基因表达（Vasudevan et al.，2008），且这种作用与ARE（AU rich element）（富含腺嘌呤/尿嘧啶原件）相關。ARE是一种活化miRs翻译的信号，能与AGO、FXRP（Fragile X retardation-1 protein）等miRISC复合物结合，而影响miRs翻译及上调基因表达。von Roretz和Gallouzi（2008）研究表明，ARE对miRs介导的mRNA衰减调控有一定影响。此外，miRs的表达具有细胞特异性，当miR-24在抑制胃癌的BCL2L11细胞中表达时，能促进细胞生长，减少细胞凋亡（Zhang et al.，2016）;而在下调肝癌的Bcl-2细胞内，miR-24表现为促进细胞凋亡（杨鹏等，2019）。因此，Novel-miR-57是否通过类似机制对DOK4基因进行调控有待进一步探究。Guittard等（2018）研究表明，通过引入外源性siRNA干扰，可同时抑制Caco-2细胞中的DOK4基因和DOK4b基因表达，但对α-管蛋白无任何影响。本研究也发现，内源性Novel-miR-57可下调DOK4基因表达，为后期揭示Novel-miR-57在其他细胞系中的功能作用提供了参考依据。

4 结论

Novel-miR-57含有7个茎环结构，且其成熟序列位于第1～3个茎环上。Novel-miR-57过表达可下调Bcap-37细胞DOK4基因表达或上调BMECs细胞DOK4基因表达，即Novel-miR-57对靶基因的调控作用还因细胞生理状态不同而存在差异。

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（責任编辑 兰宗宝）