甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因ScTDT克隆与表达分析
2021-06-30冯小艳王俊刚赵婷婷彭李顺王文治冯翠莲沈林波张树珍
冯小艳 王俊刚 赵婷婷 彭李顺 王文治 冯翠莲 沈林波 张树珍
摘要:【目的】克隆甘蔗液泡膜二羧酸轉运蛋白基因(ScTDT),并分析其在甘蔗不同组织及在铝胁迫下的表达模式,为深入研究该基因功能及抵抗铝胁迫的分子机制提供理论依据。【方法】利用同源克隆技术从甘蔗品种ROC22中克隆ScTDT基因,利用生物信息学软件进行序列分析,采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在甘蔗不同组织(根、茎和叶)及在铝胁迫(0、10和20 μmol/L Al3+)下的表达水平。【结果】克隆获得的ScTDT基因,开放阅读框(ORF)全长1623 bp,编码540个氨基酸残基,蛋白相对分子量57.34 kD,理论等电点(pI)5.77,为不稳定的疏水蛋白,可能定位于质膜、液泡和/或高尔基体,其氨基酸序列与高粱(XP_002460443.1)、水稻(XP_015612609.1)和玉米(PWZ04635.1)的TDT氨基酸序列具有高度相似性,其中与高粱的TDT氨基酸序列相似性最高,达96.30%,说明ScTDT与高粱TDT的亲缘关系最近。ScTDT基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,但根中表达量显著高于茎和叶(P<0.05,下同)。在铝胁迫处理下,3个甘蔗品种(ROC22、柳城05-136和中糖1202)的根中ScTDT基因表达量较对照组(0 μmol/L Al3+)均显著升高,尤其是柳城05-136和中糖1202随着营养液中Al3+浓度增加,ScTDT基因的表达量呈显著升高趋势,说明高浓度Al3+胁迫更能诱导ScTDT基因高效表达。3个甘蔗品种中,以中糖1202的ScTDT基因表达量变化最大,柳城05-136次之,以ROC22的变化最小。【结论】克隆获得的ScTDT基因表达具有组织特异性,在根中高效表达可能与甘蔗抵抗铝胁迫相关,即植株通过上调根中ScTDT基因表达,从而加快液泡中苹果酸的释放,促使苹果酸从根中分泌到土壤与Al3+反应,从而减少铝毒害,表明ScTDT基因可能参与甘蔗抵抗铝胁迫,且不同甘蔗品种的抗铝胁迫能力有所不同。
关键词: 甘蔗;液泡膜二羧酸转运蛋白(TDT);基因克隆;组织;铝胁迫
中图分类号: S566.106.53 文献标志码: A 文章编号:2095-1191(2021)02-0325-07
Abstract:【Objective】To clone the sugarcane tonoplast dicarboxylate transporter gene(ScTDT) and analyze its expression pattern in different tissues of sugarcane and under aluminum stress, so as to provide a theoretical basis for in-depth study of the gene function and the molecular mechanism of sugarcane resistance to aluminum stress. 【Method】Homologous cloning technology was used to clone ScTDT from sugarcane variety ROC22. Bioinformatics software was used to analyze the gene sequence. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the gene expression levels in di-fferent sugarcane tissues(root, stem and leaf) and under aluminum stress(0, 10 and 20 μmol/L Al3+). 【Result】 The cloned ScTDT gene had an open reading frame(ORF) of 1623 bp, encoding 540 amino acid residues with a relative molecular weight of 57.34 kD and a theoretical isoelectric point (pI) of 5.77. ScTDT protein was an unstable hydrophobin and may be located in plasma membrane, vacuole and/or Golgi. The amino acid sequence of ScTDT was highly similar to the amino acid sequence of TDT in sorghum(XP_002460443.1), rice(XP_015612609.1) and maize(PWZ04635.1). Among them, the TDT amino acid sequence of sorghum had the highest similarity, reaching 96.30%, indicating that ScTDT had the closest genetic relationship with TDT of sorghum. The ScTDT gene was expressed in sugarcane roots, stems and leaves, and the expression level in roots was significantly higher than that in stems and leaves(P<0.05, the same below). Under aluminum stress, the expression of ScTDT gene in the roots of the three sugarcane varieties(ROC222, Liu-cheng 05-136 and Zhongtang 1202) was significantly higher than that of the control group(0 μmol/L Al3+), especially in Liucheng 05-136 and Zhongtang 1202. With the increase of Al3+ concentration in the nutrient solution, the expression of ScTDT gene in these two varieties showed a significant increase trend, indicating that high-concentration Al3+ stress could induce the high-efficiency expression of ScTDT gene. Among the three sugarcane varieties, Zhongtang 1202 had the lar-gest change in ScTDT gene expression, followed by Liucheng 05-136, and ROC22 had the smallest change. 【Conclusion】The cloned ScTDT gene is tissue-specific, and its high expression in roots may be related to the resistance of sugarcane to aluminum stress. That is, plants can up-regulate the expression of ScTDT gene in roots to accelerate the release of malate from vacuoles, and then promote the secretion of malate from the roots into the soil to react with Al3+, thereby reducing the toxicity of aluminum, which indicates that the ScTDT gene may be involved in sugarcane resistance to aluminum stress. Different sugarcane varieties have different resistance abilities to aluminum stress.
Key words: sugarcane; tonoplast dicarboxylate transporter(TDT); gene cloning; tissue; aluminum stress
Foundation item: National Key Research and Development Program of China(2018YFD1000503); Basal Research Fund of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences(1630052020013)
0 引言
【研究意义】甘蔗(Saccharum spp.)是我国最重要的糖料作物,经提汁、清净、蒸发、结晶、分蜜和干燥等工序制成食糖。全国约90%的食糖(王明强等,2010;牛俊奇等,2018)来源于甘蔗。蔗区土壤酸化引发的铝毒害是目前制约我国甘蔗生产的主要障碍(敖俊华等,2010;卢颖林等,2016;曾巧英等,2017)。研究发现,铝胁迫下植物根系会分泌出苹果酸等有机酸阴离子与土壤中的Al3+反应形成无毒害的复合物,从而保护植株不受铝毒害(Delhaize et al.,2007;Ma,2007;Yang et al.,2013)。液泡膜二羧酸转运蛋白(Tonoplast dicarboxylate transporter,TDT)是重要的苹果酸转运体,在植物抵抗铝胁迫中发挥重要作用(Liu et al.,2017;Medeiros et al.,2017)。因此,对甘蔗TDT基因进行克隆及表达分析,对深入探究甘蔗抵抗铝胁迫的分子机制具有重要意义。【前人研究进展】苹果酸是植物代谢过程中的重要有机酸,不仅能为植物生长发育提供能量,还在植物抵抗铝胁迫、调节气孔、维持细胞质pH及渗透压平衡等过程中发挥重要作用(胡军瑜等,2009;Sweetman et al.,2009;Centeno et al.,2011;Meyer et al.,2011)。TDT是一种重要的苹果酸转运体,在苹果酸的积累和降解过程中发挥转运功能。细胞中新合成的苹果酸首先在细胞质中积累,达一定浓度后,通过TDT和苹果酸转运离子通道将其运输到液泡中储存,当细胞代谢需苹果酸时(如铝胁迫时),TDT再将苹果酸从液泡中转运出来(Hurth et al.,2005;Kovermann et al.,2007;Martinoia et al.,2007)。目前已有较多关于植物TDT及其基因的研究报道。Emmerlich等(2003)在拟南芥中鉴定到1个TDT蛋白(AtTDT),该蛋白与人类钠/二羧酸共转运蛋白高度同源,亚细胞定位于液泡膜上,且AtTDT基因在嫩叶中表达水平最高,其次为成熟叶片、茎和花,在根中几乎不表达。张燕子(2010)从苹果中克隆到1个TDT基因(MdtDT1),将其转入TDT缺失的拟南芥突变体中进行功能互补验证,结果显示MdtDT1基因对缺失突变体起到功能互补和恢复的作用。巫伟峰(2017)通过同源克隆技术从李子中克隆得到1个TDT-like基因,经基因时空表达及其与苹果酸的关联性分析发现,TDT-like基因在一定程度上正向调控苹果酸含量高的品种中苹果酸积累,但在苹果酸含量低的品种中不具有调控作用。Liu等(2017)从番茄中鉴定到1个TDT蛋白(SlTDT),亚细胞定位于液泡膜上,且SlTDT基因在根、茎、叶、花和果实中均表达;过表达SlTDT基因导致番茄果实中苹果酸含量显著升高,柠檬酸含量显著降低,而抑制SlTDT基因表达则获得相反的结果,表明SlTDT基因在番茄液泡苹果酸和柠檬酸的转运中起重要作用。【本研究切入点】目前鲜见有关甘蔗TDT基因(ScTDT)克隆及在甘蔗不同组织中和铝胁迫下表达模式研究的文献报道。【拟解决的关键问题】利用同源克隆技术从甘蔗中克隆ScTDT基因,对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其在甘蔗不同组织及铝胁迫下的表达模式,为深入研究该基因功能及抵抗铝胁迫的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
采集海南临高的甘蔗品种ROC22的根、茎和叶用于ScTDT基因组织表达模式分析。甘蔗品种ROC22、柳城05-136和中糖1202的脱毒种苗由中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验室诱导、扩繁、生根并保存,用于ScTDT基因在铝胁迫下的表达模式分析。主要试剂:EZNA Plant RNA Kit购自Omega Bio-Tek公司;RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo Scientific公司;2×Taq Plus MasterMix购自Biosharp公司;FastStart Universal SYBR? Green Master(ROX)购自Roche公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit购自爱思进生物技术(杭州)有限公司;pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技術有限公司;其他生化试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。主要仪器设备:Biometra TOne PCR仪(Analytik Jena AG,德国)、CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国)、凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)和核酸电泳系统(Bio-Rad,美国)。
1. 2 铝胁迫处理
将ROC22、柳城05-136和中糖1202的脱毒种苗置于改良的1/4 Hoagland-Arnon配方营养液中预培养15 d后,选取健康且长势一致的幼苗,以AlCl3·6H2O为铝源进行铝胁迫处理:在营养液中分别添加适量铝源,使Al3+浓度分别为0、10和20 μmol/L,每个处理设置3个生物学重复。胁迫处理24 h后,采集植株的根置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1. 3 基因克隆
按照EZNA Plant RNA Kit说明提取ROC22叶片的总RNA,经RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA第一链。从甘蔗转录组数据中挖掘出与高粱TDT基因高度同源的Unigene,利用Primer Premier 5.0设计其全长克隆引物ScTDT-F:5'-ATGGATCCGCGGCGCGGCTA-3'和ScTDT-R:5'-CTATGCCATGCCAAAAACCAGAG-3'。以cDNA为模板进行PCR扩增,反应体系50.0 μL:2×Taq Plus MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,cDNA模板 1.0 μL,ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经AxyPrep DNA Gel Extraction Kit回收后连接至pMD19-T载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并挑选阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1. 4 生物信息学分析
使用ExPASy的ProtParam分析ScTDT蛋白的氨基酸组成、等电点及分子量等理化性质,使用WoLF PSORT预测其亚细胞定位。使用NCBI数据库的BLASTp查找ScTDT的同源氨基酸序列,并利用MEGA 5.0的邻接法(Neighbor-joining,NJ)(BootStrap为1000)构建系统发育进化树。
1. 5 表达模式分析
根据ScTDT基因全长序列,利用Primer Premier 5.0设计其RT-qPCR引物(ScTDT-Q-F:5'-CCACGCT CTGCCTCATGTAC-3'和ScTDT-Q-R:5'-CCCAGGG ATGTCGTCTGTTAG-3')。以GADPH为内参基因,其引物为GADPH-Q-F:5'-CACGGCCACTGGAAG CA-3'和GADPH-Q-R:5'-TCCTCAGGGTTCCTGAT GCC-3'(Iskandar et al.,2004)。以ROC22的根、茎和叶及铝胁迫处理的ROC22、柳城05-136和中糖1202脱毒种苗的根为样品。利用EZNA Plant RNA Kit分别提取其总RNA,经RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA第一链。参照FastStart Universal SYBR? Green Master(ROX)配制RT-qPCR反应体系。扩增程序:95 ℃预变性10 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,进行40个循环;增加溶解曲线。设置3次技术重复。利用2-△△Ct方法计算基因相对表达量(Livak and Schmittgen,2001),最后利用SPSS 19.0进行显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 ScTDT基因克隆及序列分析结果
以ROC22叶片的cDNA为模板,PCR扩增到一条1600 bp左右的条带(图1),与预期结果相符。回收该片段连接至pMD19-T载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆进行测序,结果(图2)显示该片段长度为1623 bp,编码540个氨基酸残基。
2. 2 系统进化分析结果
使用NCBI数据库的BLASTp查找克隆获得的基因编码蛋白的同源氨基酸序列,结果发现其氨基酸序列与高粱(XP_002460443.1)、水稻(XP_015612609.1)和玉米(PWZ04635.1)的TDT氨基酸序列具有高度相似性,分别为96.30%、88.60%和84.87%,说明ScTDT与高粱TDT的亲缘关系最近(图3),进一步证实克隆获得的基因序列为ScTDT基因。
2. 3 生物信息学分析结果
利用ExPASy的ProtParam对ScTDT蛋白的理化性质进行预测,结果显示该蛋白的分子式为C2621H4154N656O718S31,相对分子量为57.34 kD,理论等电點(pI)为5.77,富含亮氨酸(占14.4%)、丙氨酸(占10.6%)和甘氨酸(占9.8%),不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸,共含40个负电荷残基(天冬氨酸+谷氨酸)和34个正电荷残基(精氨酸+赖氨酸);该蛋白在体外哺乳动物网织红细胞的预计半衰期为30 h,脂肪指数为114.54;不稳定系数II为41.14,亲水性平均值(GRAVY)为0.654,推测其是不稳定的疏水蛋白。利用WoLF PSORT对ScTDT蛋白进行亚细胞定位,结果显示,ScTDT蛋白可能定位于细胞质膜、液泡和/或高尔基体。
2. 4 ScTDT基因的组织表达分析结果
由图4可知,ScTDT基因在甘蔗的根、茎和叶中均有表达,但不同组织中的表达量存在显著差异(P<0.05,下同),其中以根中的表达量最高,是茎的3.45倍,叶中次之,是茎的1.93倍,以茎中的表达量最低,说明ScTDT基因表达具有组织特异性。
2. 5 ScTDT基因在铝胁迫下的表达分析结果
由图5可知,在铝胁迫处理下,3个甘蔗品种的根中ScTDT基因表达量较对照组(0 μmol/L Al3+)均显著升高,尤其是柳城05-136和中糖1202随着营养液中Al3+浓度增加,ScTDT基因的表达量呈显著升高趋势,说明高浓度Al3+胁迫更能诱导ScTDT基因高效表达。3个甘蔗品种中,以中糖1202基因的表达量变化最大,10和20 μmol/L Al3+胁迫处理下ScTDT基因的表达量分别显著升高至对照组的5.40和10.00倍;柳城05-136次之,10和20 μmol/L Al3+胁迫处理下ScTDT基因的表达量分别显著升高至对照组的1.95倍和2.54倍;ROC22的基因表达量变化最小,10和20 μmol/L Al3+胁迫处理下ScTDT基因的表达量分别显著升高至对照组的1.25和1.30倍。
3 讨论
植物通过根系分泌苹果酸等有机酸阴离子与Al3+反应形成无毒害复合物以抵抗铝胁迫(Delhaize et al.,2007;Yang et al.,2011;Chen,2012;Yang et al.,2013)。此过程分泌的苹果酸来源于细胞质,而细胞质中苹果酸含量需维持在一定水平以保证细胞的正常代谢,液泡与细胞质间苹果酸的快速交换是维持细胞质苹果酸含量的主要方式(Delhaize et al.,2007;Yang et al.,2013)。而TDT是在液泡和细胞质间运输苹果酸的重要转运体,说明其在植物抵抗铝胁迫过程中发挥作用(Hurth et al.,2005;Martinoia et al.,2007)。本研究利用同源克隆技术从甘蔗中克隆获得ScTDT基因,开放阅读框(ORF)全长1623 bp,编码540个氨基酸残基,其氨基酸序列与高粱、水稻和玉米的TDT具有高度的相似性,为探究不同物种抵抗铝胁迫的分子机制打下基础。
TDT在液泡的苹果酸和柠檬酸转运中起重要作用(Liu et al.,2017)。Emmerlich等(2003)、Liu等(2017)通过绿色荧光蛋白瞬时表达的亚细胞定位方法分别将拟南芥AtTDT和番茄SlTDT定位于液泡膜上,表明亚细胞定位结果与蛋白功能相符。巫伟峰(2017)利用生物信息学软件预测发现李子的TDT-like蛋白也定位于液泡膜上。本研究利用生物信息学软件预测发现ScTDT定位于细胞质膜、液泡和/或高尔基体,实际定位仍有待进一步试验分析验证。
前人研究表明,TDT基因表达具有组织特异性。如拟南芥AtTDT基因在茎、叶和花中表达,其中在嫩叶中表达量最高,其次为成熟叶片、茎和花,在根中几乎不表达(Emmerlich et al.,2003)。番茄SlTDT基因在根、茎、叶、花和果实中均有表达,其中嫩叶中表达量最高,根和果实中表达量较低(Liu et al.,2017)。本研究发现,ScTDT基因在甘蔗的根、茎和叶中均有表达,且根中表达量显著高于茎和叶,与AtTDT和SlTDT基因(Emmerlich et al.,2003;Liu et al.,2017)存在明显差异,其原因可能是TDT在不同植物中的主要功能不同,如AttDT和SlTDT在嫩叶中高效表达暗示二者可能参与叶片的光合代谢(Emmerlich et al.,2003;Liu et al.,2017),而ScTDT在根中高效表达则可能与甘蔗抵抗铝胁迫相关。
为了探究ScTDT基因在甘蔗抵抗铝胁迫过程中的作用机制,本研究对3个甘蔗品种进行铝胁迫处理,并分析其根中ScTDT基因的表达模式,结果显示,3个甘蔗品种根中ScTDT基因均受铝胁迫诱导上调表达,且高浓度Al3+胁迫更能诱导ScTDT基因高效表达,说明ScTDT基因可能在甘蔗抵抗铝胁迫过程中发挥作用,即植株通过上调ScTDT基因表达,从而加快液泡中苹果酸的释放,促使苹果酸从根中分泌到土壤中与Al3+反应,从而减少铝毒害(Martinoia et al.,2007;Yang et al.,2013)。3个甘蔗品种在铝胁迫下,以中糖1202的ScTDT基因表达量变化最大,柳城05-136次之,ROC22的变化最小,由此推测,3个甘蔗品种抵抗铝胁迫的能力由高到低依次是中糖1202、柳城05-136和ROC22。但中糖1202、柳城05-136和ROC22实际抗铝胁迫能力有待进一步田间验证,且ScTDT基因在甘蔗抵抗铝胁迫的具体作用机制尚不清楚,有待深入研究。
4 结论
克隆获得ScTDT基因具有组织表达特异性,在根中高效表达可能与甘蔗抵抗铝胁迫相关,即植株通过上调根中ScTDT基因表达,从而加快液泡中苹果酸的释放,促使苹果酸从根中分泌到土壤与Al3+反应,从而减少铝毒害,表明ScTDT基因可能参与甘蔗抵抗铝胁迫,且不同甘蔗品种的抗铝胁迫能力有所不同。
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(责任编辑 陈 燕)