豇豆不同生长时期施用毒死蜱的膳食风险

王 娣，狄珊珊，王新全，张昌朋，王祥云，*，王 萌，章程辉

(1.海南大学 园艺学院，海南 海口 570228； 2.农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，农业农村部农药残留检测重点实验室，浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021； 3.海南大学 植物保护学院，海南 海口 570228； 4.海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口 570228)

豇豆富含多种维生素和植物蛋白质等营养成分[1]，且易栽培、种植范围广[2]，深受消费者的喜爱。但是豇豆作为花果同期作物的代表[3]，在生产过程中极易受到病虫侵害，在这种次第开花、连续采摘的生产模式下，菜农需频繁施用农药以控制花期病虫害，从而显著增加了豇豆中的农药残留风险。

毒死蜱(chlorpyrifos)，商品名为乐斯本，是一种具有触杀、胃毒等作用的广谱有机磷杀虫杀螨剂[4]，主要原理是抑制害虫体内的乙酰胆碱酯酶或胆碱酯酶的活性[5]，可防治豇豆上的蚜虫[6]、豆荚螟[7]、美洲斑潜蝇[8]等害虫。由于毒死蜱残留期长，大多数蔬菜的采收时间短，使用毒死蜱容易造成蔬菜农残超标，同时毒死蜱对水生生物有极高毒性，长期使用对水体环境、水生生物甚至是对人体健康产生长期不良影响[9-11]。为保障消费者的生命健康，农业部2032号公告规定，自2016年12月31日起禁止毒死蜱在蔬菜上使用[12]。但此后市场抽样结果显示，豇豆中仍有毒死蜱频繁检出乃至超标，如国家市场监督管理总局发布的通告中2018年在江苏省扬州市抽样的豇豆中毒死蜱检出超标[13]，2019年在山西省河津市抽样的豇豆中毒死蜱检出超标[14]。为有效降低农药的残留风险，课题组开展了禁限用农药乐果[15]和丁硫克百威[16]在豇豆不同生长时期的施用研究，发现通过控制农药使用时期可有效降低农药残留进而降低膳食摄入风险。

因此，为明确毒死蜱在豇豆不同生长时期的使用风险，针对豇豆的生长特点，本研究开展播种期、苗期、结荚期一次施药、结荚期二次施药和结荚盛期一次施药5种场景的田间试验，按照一定的时间间隔采集成熟豇豆样品，以QuEChERS的前处理方法结合超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定其中的残留量。通过慢性膳食摄入风险和急性膳食摄入风险评估，明确消费者食用豇豆而摄入毒死蜱的潜在健康风险，最终为豇豆生产中的农药合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS，TQ-XS三重四级杆检测器，美国Waters公司)；离心机(Heraeus biofuge primo R，美国Thermo scientific公司)；电子天平(BSA2202S，北京塞多利斯科学仪器有限公司)；旋涡混合器(QT-2，上海琪特分析仪器有限公司)。

毒死蜱固标(纯度98.9%，北京坛墨质检科技有限公司)。30%毒死蜱微囊悬浮剂(山东中信化学有限公司)。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；Mili-Q超纯水(美国Milipore公司)；无水硫酸镁(分析纯，永华化学科技江苏有限公司)，氯化钠(分析纯，广东光华科技股份有限公司)，Agela Cleanert MAS-Q净化管(50 mg C18、50 mg PSA和150 mg无水硫酸镁，天津博纳艾杰尔科技有限公司)，有机相滤膜(0. 22 μm，天津博纳艾杰尔公司)。

1.2 分析方法

1.2.1 样品前处理

准确称取10 g匀浆后的豇豆样品(精确至0.01 g)至50 mL离心管，加入10 mL乙腈，涡旋提取3 min，加入6 g无水硫酸镁和1.5 g氯化钠后立即手动剧烈振摇1 min，随后以5 000 r·min-1离心5 min；取上清液1.5 mL至Agela Cleanert MAS-Q净化管中，涡旋混匀30 s后以5 000 r·min-1离心5 min，取1.0 mL上清液经0.22 μm滤膜过滤至进样小瓶，待LC-MS/MS测定。

1.2.2 仪器条件

液相色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.10 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；流动相为体积分数90%的甲醇溶液；流速0.20 mL·min-1；柱温40 ℃；进样时间5 min；进样体积1 μL。

质谱条件：采用多反应监测模式(MRM)；离子源为ESI(+)；气帘气40 psi；离子化电压+3 000 V；温度450 ℃；喷雾气30 psi；辅助加热气30 psi。

毒死蜱特征离子对(去簇电压、碰撞能量):m/z350.1 > 197.9 (25 V、19 eV)、m/z350.1 >97 (25 V、33 eV)，其中，m/z350.1 > 197.9为定量离子对。毒死蜱的保留时间为1.12 min。

1.2.3 标准溶液配制和标准曲线的绘制

准确称量毒死蜱固体标样(纯度98.9%)0.010 1 g，以乙腈定容，配制为1 000 mg·L-1的标准储备液。用乙腈逐级稀释，得到0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005 mg·L-1的毒死蜱溶剂标准溶液。以1.2.1节获得的空白豇豆提取液分别配制0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005 mg·L-1的毒死蜱基质匹配标准溶液。以质量浓度为横坐标(x)，相应的峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。具体仪器条件测定方法同1.2.2节。

1.2.4 添加回收试验

在空白豇豆样品中添加0.01、0.1、1、5 mg·kg-1的毒死蜱标准溶液，每个处理5个重复，涡旋混匀后静置30 min，使化合物被豇豆样品充分吸收。样品前处理和仪器测定同1.2.1节和1.2.2节。计算方法的平均回收率和相对标准偏差。1、5 mg·kg-1回收样品检测前稀释至标准曲线线性范围内进样，对应基质匹配标准溶液使用相同稀释倍数的基质空白进行配制。田间样品需稀释测定时也采用相同的做法。

1.3 田间试验

试验于浙江省农业科学院基地进行。该试验区田块前3 a未种植过豆类作物，未喷施过毒死蜱。根据豇豆的生长特点，分为播种期、苗期、结荚期一次施药、结荚期二次施药和结荚盛期一次施药5种施药场景。使用30%毒死蜱微囊悬浮剂，设置毒死蜱在播种期的施药剂量为2 250 mL·hm-2(以有效成分计，下同)，施药方式为灌根。在苗期、结荚期一次施药、结荚期二次施药、结荚盛期一次施药的施药剂量均为576 mL·hm-2，施药方式均为喷雾。每个处理重复3次，四周设保护带，每试验小区的面积均为30 m2。

播种期采用灌根的施药方式，用量筒准确量取22.5 mL制剂，兑水稀释400倍至塑料大桶中配制成稀释药液，每个小区180穴，每穴3～4粒豇豆种子，穴距约20cm，用量筒量取每穴灌根稀释药液的量为50 mL，于播种后56、58、62 d采集成熟期豇豆。苗期为豇豆出苗15 d后，每隔7 d喷雾施药一次，在豇豆始花期前5d进行最后一次施药，最后一次施药后20、22和26 d采集成熟豇豆样品；结荚期为豇豆始花期开始第一次施药，间隔5 d后进行第二次施药，最后一次施药后10、12、16 d采集成熟豇豆样品；同时在结荚盛期进行一次施药并于施药后2 h (0 d)及1、2、3、5、7、10、14 d采样。

每个小区的边行和每行两边0.5 m不进行采样，在小区内12个以上的采样点，随机采集豇豆样品，每个小区采集1 kg装入样本容器中包扎妥当，带回实验室处理。样品经不锈钢刀具切成2～4 cm大小的小段，用四分法缩分样本，分取500 g样品，经匀浆后装入封口样品容器中，贴好标签，放入低温冰箱(-20℃)中待测。

1.4 慢性膳食摄入风险和急性膳食摄入风险

农药的慢性膳食摄入风险(%ADI)和急性膳食摄入风险(%ARfD)参照文献[17]计算得出。其中，每标准人体重按60 kg计；参考GB 2763—2019[18]，毒死蜱的日允许摄入量(ADI)为0.01 mg·kg-1·d-1；参考联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)[19]数据，某类食品一餐的最大消费量(LP)取值为0.5487 kg，以可食部分计的产品单个质量(U)为0.083 kg，毒死蜱变异因子(v)取值为3，急性参考剂量(ARfD)以0.1 mg·kg-1·d-1计。

当%ADI或%ARfD≤100%时，表示其风险为可接受，值越小，风险越小；当%ADI或%ARfD>100%时，表示有不可接受的风险，值越大风险越大。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围、准确度和精密度

在0.005～0.5 mg·L-1范围内，毒死蜱的峰面积(y)与质量浓度(x)间具有良好的线性，溶剂标准溶液和基质匹配标准溶液的线性回归方程分别为y=4 191.1x- 14 255(R2=0.999 8)，y=3 289.3x-848.12(R2=0.999 9)，相关系数R2均大于0.999，方法定量限(LOQ)为0.01 mg·kg-1。经计算，本方法存在基质抑制效应。为降低基质效应、提高检测的准确性，本实验采用基质匹配标准溶液校正方法对基质效应进行了补偿。

添加回收试验表明(表1)：0.01～5 mg·kg-1添加水平下，毒死蜱的平均回收率为76.3%～88.3%，相对标准偏差为2.7%～6.4%，均符合NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》[20]中关于添加回收试验的要求。

表1 毒死蜱在豇豆中的平均添加回收率及相对标准偏差

2.2 毒死蜱在不同时期施药的残留与膳食摄入风险

2.2.1 毒死蜱在播种期、苗期、结荚期施药的残留与膳食摄入风险

按照试验剂量施药后，在各处理成熟期采集的豇豆样品，即播种期施药后56 d、苗期施药后20 d、结荚期一次施药后15 d、结荚期二次施药后10 d开始采集的豇豆中均无毒死蜱检出。因此，无需进一步开展膳食风险评估。

2.2.2 毒死蜱在结荚盛期施药的残留及膳食摄入风险

按前述田间试验设计在结荚盛期进行了一次施药，使用30%毒死蜱微囊悬浮剂喷雾，喷药后间隔不同时间采摘豇豆样品进行残留量测定并进行了慢性膳食摄入风险和急性膳食摄入风险评估。毒死蜱在豇豆结荚盛期一次施药后的残留和膳食风险评估结果如表2和图1所示，残留消解曲线为Ct=1 726.6e-0.431t(R2=0.981 5)，符合一级动力学方程。从测定结果可以看出，毒死蜱在豇豆中的残留量随着时间延长而递减。我国GB 2763—2019[18]未规定毒死蜱在豇豆上的最大残留限量(MRL)，规定菜豆的MRL为1 mg·kg-1，美国规定毒死蜱在豆类蔬菜的MRL为0.05 mg·kg-1[21]。施药后2 h，豇豆中毒死蜱初始沉积量为2.09 mg·kg-1，之后毒死蜱的残留量逐渐减少。到2 d残留量降至1 mg·kg-1以下，符合GB 2763—2019在菜豆的MRL限量值，到10 d残留量降至0.05 mg·kg-1以下，符合美国的MRL限量值，但要达到绿色食品[22]的要求(残留量低于0.01 mg·kg-1)需要14 d。可见，毒死蜱在豇豆中前期降解较快，半衰期较短(t1/2=1.6 d)。慢性膳食风险和急性膳食风险评估结果显示，食用喷施本试验剂量(576 mL·hm-2)毒死蜱的豇豆膳食摄入风险可接受。

表2 毒死蜱在豇豆中的残留量及膳食摄入风险

图1 毒死蜱在豇豆中的残留动态Fig.1 Residue dynamics of chlorpyrifos in cowpea samples

3 结论

按试验剂量(576 mL·hm-2)使用，毒死蜱在豇豆中的半衰期为1.6 d，在豇豆中的残留量随着时间延长而递减。毒死蜱在豇豆中前期降解较快，后期降解较慢，导致残留期较长。到2 d残留量降至1 mg·kg-1以下，符合GB 2763—2019在菜豆的MRL限量值，到10 d残留量才降至0.05 mg·kg-1以下，符合美国在豆类蔬菜的MRL限量值，但要达到绿色食品的要求(残留量低于0.01 mg·kg-1)需要14 d。毒死蜱在播种期使用2 250 mL ai·hm-2的施药剂量灌根。在苗期、结荚期一次施药、结荚期二次施药的施药剂量为576 mL ai·hm-2，施药方式均为喷雾，施药后分别间隔66、20、15、10 d开始采摘的成熟期豇豆是可以安全食用的。

慢性膳食风险和急性膳食风险评估结果显示，食用喷施本试验剂量(576 mL·hm-2)毒死蜱的豇豆膳食摄入风险可接受。因此，播种期和苗期施用毒死蜱不会导致成熟期采收的豇豆残留超标，可以安全使用，但始花期后的使用需控制10 d以上的采收间隔期。然而豇豆作为典型的花果同期作物，在这种次第开花、连续采摘的生产模式下，结荚盛期每隔1～2 d即需采收，无法确保安全间隔期，结荚盛期须禁止使用毒死蜱。这与我国禁止毒死蜱在豇豆上使用的政策相吻合，该政策的提出可能是由于毒死蜱在豇豆结荚期施用后至采摘前间隔期较短，农户在实际生产中无法保证安全间隔期进而容易造成残留超标。然而近年来，禁用农药毒死蜱在豇豆中被高频检出，已成为豇豆中农残超标率居高不下的关键问题之一。综上表明，在尚未制定毒死蜱在豇豆生产中精准施用规范的背景下，我国禁止毒死蜱在豇豆生产中的使用是十分必要的。

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