miR-409-3p通过调控SLBP影响肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭

周 杰，李敬东，权 刚，孙 骥，岳 亮

1.川北医学院附属医院肝胆一科，四川 南充 637000；2.成都中医药大学医学与生命科学学院

肝癌是临床常见恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率较高，患者5年生存率较低[1-4]。miR-409-3p是一种在胃癌等几种癌症中表达下调的miRNA，并通过增殖、分化等生物学过程参与肿瘤进展调控[5]。生物信息学分析显示，茎环结合蛋白(stem-loop binding protein，SLBP)与miR-409-3p存在靶向结合序列，资料显示SLBP表达在骨肉瘤[6]、乳腺癌[7]等肿瘤中被上调，并可参与肿瘤细胞生长及转移过程。本研究主要探讨miR-409-3p、SLBP在肝癌细胞系中的表达，分析miR-409-3p在肝癌细胞增殖、迁移及侵袭中的作用，并结合其对SLBP的调控旨在揭示肝癌中miR-409-3p的机制，为阐明肝癌病理进展的分子机理提供新的启示。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂肝癌组织及癌旁组织来源：选取2017年5月至2018年6月我院收治的30例肝癌患者为研究对象，所有患者均经病理证实为肝癌，男20例，女10例，年龄(56.35±12.36)岁(40～70岁)，所有患者均于术中切除肝癌组织及癌旁组织，置于-80 ℃超低温冰箱保存。

人肝上皮细胞(THLE-3)、肝癌细胞系(MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1)购自美国ATCC。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；miR-409-3p寡核苷酸模拟物(miR-409-3p mimics)、miR-409-3p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-409-3p)、SLBP小干扰RNA(si-SLBP)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、抑制剂NC序列(anti-miR-NC)、乱序无意义小干扰RNA序列(si-NC)购自广州市锐博生物科技有限公司；反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；MTT与DMSO购自美国BD公司；凋亡试剂盒购自美国Sigma公司；兔抗人SLBP抗体购自美国Abcam公司；兔抗人细胞周期蛋白1(Cyclin D1)、兔抗人基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases2，MMP2)、兔抗人基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)抗体购自美国Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染及分组：在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中，用DMEM完全培养基(含有质量浓度为100 g/L的胎牛血清)培养THLE-3、MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1细胞。取对数期Hep3B细胞1×104个/ml接种于6孔板(150 μl/孔)，待细胞生长融合至70%时将培养基更换为不含胎牛血清的DMEM，参照Lipofectamine 2000说明书分别按miR-NC组(转染miR-NC)、miR-409-3p组(转染miR-409-3p mimics)、si-NC组(转染si-NC)、si-SLBP组(转染si-SLBP)、miR-409-3p+pcDNA-NC组(转染miR-409-3p mimics和pcDNA-NC)、miR-409-3p+pcDNA-SLBP组(转染miR-409-3p mimics和pcDNA-SLBP)进行Hep3B细胞转染。

1.2.2 qRT-PCR检测miR-409-3p、SLBP mRNA的表达水平：取出冻存肝癌组织及癌旁组织，采用Trizol法提取组织中的总RNA，同时提取THLE-3、MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1细胞和转染后Hep3B细胞中的总RNA，在超微量分光光度计(Nanodrop 2000c)上进行RNA浓度测量。根据反转录试剂盒操作指示将RNA反转录。以合成的cDNA为模板，与引物、SYBR Green试剂盒在95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40次循环(miR-409-3p)，或95 ℃ 60 s，95 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40次循环(SLBP)的反应条件下进行qRT-PCR反应。采用2-ΔΔCt法计算miR-409-3p(内参为U6)、SLBP mRNA(内参为β-actin)的相对表达量。

1.2.3 MTT检测细胞增殖：收集各组对数期Hep3B细胞(3×104个/ml)，接种于96孔板(100 μl/孔)，每组设置3个复孔，每孔加入MTT溶液20 μl，置于37 ℃培养箱继续培养4 h，1 300 r/min离心5 min，弃上清，每孔滴加DMSO 150 μl，应用酶标仪检测各孔避光充分反应5 min后的吸光度值(OD490 nm)，计算细胞增殖率(%)=OD490 nm实验组/OD490 nm空白组×100%。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭：无血清培养基稀释Matrigel基质胶，并铺板Transwell上室(40 μl/孔)，以进行侵袭检测。收集各组对数期Hep3B细胞，无血清培养基调整为3×104个/ml，按照200 μl/孔的密度将细胞悬液加入铺Matrigel基质胶(侵袭检测)或未铺Matrigel基质胶(迁移检测)的上室。另取600 μl含质量浓度为100 g/L胎牛血清的培养液加入下室，37 ℃反应24 h，多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下观察迁移细胞数。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测miR-409-3p的靶基因：分别构建野生型载体WT-SLBP与突变型载体MUT-SLBP，在Hep3B细胞中共转染WT-SLBP、MUT-SLBP与miR-NC、miR-409-3p mimics，检测转染24 h后的细胞相对荧光素酶活性。分别将miR-NC、miR-409-3p、anti-miR-NC、anti-miR-409-3p转染至Hep3B细胞，采用Western blotting进行SLBP蛋白表达测定。

1.2.6 Western blotting检测SLBP、Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达：收集THLE-3、MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1细胞与转染后Hep3B细胞，在RIPA裂解液中进行总蛋白的分离提取，进行SDS-PAGE(50 μg)和转PVDF膜，PVDF膜在质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉中封闭，2 h后于4 ℃与1∶1 000稀释的一抗孵育12 h，室温与1∶2 000稀释的二抗孵育1 h，滴加ECL，各条带显影后的灰度值在软件Image J中获得。

2 结果

2.1 在肝癌组织与细胞系中miR-409-3p和SLBP表达情况肝癌组织中miR-409-3p的表达水平较癌旁组织降低(P<0.05)，SLBP mRNA及SLBP蛋白表达水平均较癌旁组织升高(P<0.05)；肝癌细胞系MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1中miR-409-3p的表达水平均较THLE-3细胞降低(P<0.05)，SLBP mRNA及SLBP蛋白表达水平均较THLE-3细胞升高(P<0.05)，其中对肝癌细胞Hep3B中miR-409-3p的表达水平降低幅度明显高于其他肝癌细胞系，因而选用肝癌细胞Hep3B进行后续研究(见图1～2、表1)。

表1 在肝癌细胞系中miR-409-3p和SLBP表达情况Tab 1 Expression of miR-409-3p and SLBP in liver

注：*P<0.05。图1 肝癌组织中miR-409-3p和SLBP mRNA的表达情况 A：miR-409-3p在肝癌组织中的表达；B：SLBP mRNA在肝癌组织中的表达Fig 1 Expression of miR-409-3p and SLBP mRNA in liver cancer tissues A:expression of miR-409-3p in liver cancer tissues;B:expression of SLBP mRNA in liver cancer tissues

图2 Western blotting检测SLBP蛋白表达 Fig 2 The expression of SLBP protein detected by Western blotting

2.2 高表达miR-409-3p对肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的影响miR-409-3p组细胞增殖率较miR-NC组降低(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数较miR-NC组减少(P<0.05)，Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白相对表达量也较miR-NC组降低(P<0.05)(见图3、表2)。

注：*P<0.05。图3 高表达miR-409-3p对肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的影响 A：MTT检测细胞增殖率；B：Transwell检测细胞迁移和侵袭；C：Western blotting检测Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白的表达Fig 3 Effects of highly expressed miR-409-3p on the proliferation,migration and invasion of liver cancer cell Hep3B A:cell proliferation rate detected by MTT;B:cell numbers of migration and invasion detected by Transwell;C:Cyclin D1,MMP2 and MMP9 protein expressions detected by Western blotting

表2 高表达miR-409-3p对肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的影响Tab 2 Effects of highly expressed miR-409-3p on the proliferation,migration and invasion of liver cancer cells Hep3B

2.3 低表达SLBP对肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的影响si-SLBP组肝癌细胞增殖率低于si-NC组(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数少于si-NC组(P<0.05)，Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白相对表达量也低于si-NC组(P<0.05)(见图4、表3)。

注：*P<0.05。图4 低表达SLBP对肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的影响 A：MTT检测细胞增殖率；B：Transwell检测细胞迁移和侵袭；C：Western blotting检测SLBP、Cyclin D1、MMP2和MMP9的蛋白表达Fig 4 Effects of low expressed SLBP on the proliferation,migration and invasion of liver cancer cell Hep3B A:cell proliferation rate detect by MTT;B:cell numbers of migration and invasion detected by Transwell;C:protein expressions of SLBP,Cyclin D1,MMP2 and MMP9 detected by Western blotting

表3 低表达SLBP对肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的影响Tab 3 Effects of low expressed SLBP on the proliferation,migration and invasion of liver cancer cell Hep3B

2.4 miR-409-3p靶向SLBPmiR-409-3p与SLBP的结合位点在Starbase中预测(见图5A)。转染WT-SLBP细胞荧光素酶活性在miR-409-3p组中显著低于miR-NC组(P<0.05)(见表4)。miR-409-3p可负向调控SLBP的表达(见图5B、表5)。

表5 Western blotting检测miR-409-3p对SLBP表达的影响Tab 5 Western blotting was used to detect the expression of SLBP regulared by miR-409-3p

图5 miR-409-3p靶向调控SLBP表达 A：Starbase预测示意图；B：Western blotting检测miR-409-3p对SLBP表达的影响Fig 5 miR-409-3p targeted the expression of SLBP A:Starbase predicted the combination of miR-409-3p and SLBP;B:Western blotting was used to detect the expression of SLBP regulared by miR-409-3p

表4 SLBP报告质粒与miR-409-3p共转染Hep3B细胞的荧光素酶活性Tab 4 Luciferase activity of Hep3B cells co-transfected with SLBP reporter plasmid and miR-409-3p

2.5 miR-409-3p通过调控SLBP影响Hep3B的增殖、迁移和侵袭miR-409-3p+pcDNA-SLBP组Hep3B细胞增殖率比miR-409-3p+pcDNA-NC组升高(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数较miR-409-3p+pcDNA-NC组增多(P<0.05)，Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白相对表达量较miR-409-3p+pcDNA-NC组升高(P<0.05)(见图6、表6)。

注：*P<0.05。图6 高表达SLBP可以部分逆转miR-409-3p对Hep3B增殖、迁移和侵袭的影响 A：MTT检测细胞增殖率；B：Transwell检测细胞迁移和侵袭；C：Western blotting检测SLBP、Cyclin D1、MMP2和MMP9的蛋白表达Fig 6 Highly expressed SLBP could partially reverse the effects of miR-409-3p on Hep3B proliferation,migration and invasion A:cell proliferation rate detected by MTT;B:cell numbers of migration and invasion detected by Transwell;C:expressions of SLBP,Cyclin D1,MMP2 and MMP9 proteins detected by Western blotting

表6 miR-409-3p通过调控SLBP影响Hep3B增殖、迁移和侵袭Tab 6 miR-409-3p influenced the proliferation,migration and invasion of Hep3B by regulating SLBP

3 讨论

miRNA在多种肿瘤中发挥致癌或抑癌作用，研究表明miRNA在肝癌组织或细胞系中异常表达并可促进或抑制肝癌发生及发展，其作用机制可能是通过靶向调控下游靶基因而发挥作用[8-10]。

miR-409-3p在乳腺癌细胞中表达下调，上调miR-409-3p表达可通过靶向Akt1从而抑制乳腺癌细胞生长及侵袭[11]。研究表明，miR-409-3p可抑制骨肉瘤细胞增殖及侵袭[12]。相关报道指出，miR-409-3p过表达可抑制神经胶质瘤细胞增殖及侵袭[13]。与上述研究结果相似，本研究结果显示，miR-409-3p在肝癌细胞系中表达下调，miR-409-3p过表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。Cyclin D1可正向调控细胞周期而促进细胞增殖[14]。MMP2、MMP9是细胞迁移和侵袭的重要诱导因子[15]。本研究结果表明，miR-409-3p过表达可抑制Cyclin D1、MMP2、MMP9表达，提示miR-409-3p过表达可减弱肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。

SLBP可调控细胞周期，并可能参与肿瘤发生及发展过程[16-17]。本研究结果显示，SLBP在肝癌中显著上调，抑制SLBP表达后，肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力被减弱。本研究证实SLBP是miR-409-3p的靶标，miR-409-3p对肝癌细胞中SLBP的表达具有负向调控作用。同时，miR-409-3p可能通过靶向下调SLBP表达，从而在肝癌细胞生长和转移中发挥抑制功能。

综上所述，miR-409-3p可靶向调控SLBP表达从而影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，miR-409-3p在肝癌发生及转移过程中发挥重要调控作用，miR-409-3p可能作为肝癌的分子治疗靶点，但仍需通过动物实验验证miR-409-3p在体内对肝癌细胞生长的抑制作用。