高通量测序与传统纯培养方法在溱潼鱼丸微生物群落分析中的应用对比研究

张璟晶，彭庆旺，陈玉勇，唐劲松，秦金燕

（江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏 泰州 225300）

溱潼鱼丸是江苏省泰州市姜堰区传统鱼糜制品小吃，从古至今制作工艺讲究，保持和突出了传统产品的优点，但溱潼鱼丸因工艺的特殊性在原料及加工过程中会带入微生物，也可能由于包装或储藏等因素而更容易出现变质现象。目前国内对鱼丸的研究主要集中在鱼丸加工工艺的研究和影响鱼丸质量的因素上，而对鱼丸中微生物结构的分析及导致腐败的微生物研究鉴定甚少，对溱潼鱼丸中微生物群落分析及腐败菌的鉴别尚未见报道。

目前常通过分离纯化、个体形态鉴定、生理生化鉴定等对微生物种类进行鉴定[1-2]。以16SrDNA特定可变高通量测序是近年研究微生物种类多样性的新手段，对于研究微生物群落的组成及比例具有明显的优势[3]。目前该技术应用在不同种类食品中的微生物分析鉴定[4-6]，但该技术在水产品鱼糜制品中的应用研究尚未见报道。本文采用IIIumina HiSeq第二代测序技术对溱潼鱼丸在4℃下储藏期内微生物的多样性进行测序，并与传统方法结合，对溱潼鱼丸中微生物结构的多样性进行分析，对主要微生物进行分离鉴定，研究溱潼鱼丸中微生物的种类及其在储藏期间微生物的变化，为下一步鱼丸的防腐保鲜、延长产品的保质期奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

试验用鱼丸购自溱潼农贸超市。

营养琼脂培养基（NA培养基）、营养肉汤（NB肉汤）、革兰氏染色液、微生物生理生化微量鉴定管等：北京陆桥技术有限责任公司；PCR扩增试剂及引物、DNA提取试剂盒、溶菌酶等：生工生物（上海）股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

EL270型电子天平：梅特勒-托多利仪器（上海）有限公司；LDZX30FA型立式压力蒸汽灭菌锅、HPX9162型电热恒温培养箱、SW-CJ-ZFD型超净工作台：上海博讯实业有限公司；PTC200型PCR扩增仪、YLN2000A型凝胶成像分析仪：生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鱼丸预处理

将从市场买来的鱼丸表面用75%的无水乙醇擦拭后晾干，于无菌环境下定量分装，至无菌袋中，每袋10 g，分为两组（A组和B组），于4℃低温下储藏。

1.2.2 鱼丸预增菌处理

将鱼丸分组进行取样，A组鱼丸按储藏时间在第1天和第3天取样后，使用蛋白胨肉汤进行30℃过夜增菌培养，记为A1、A3；B组鱼丸于第1天和第3天取样后不增菌，记为B1、B3。

1.2.3 平板分离培养和菌株种类鉴定

1.2.3.1 平板分离培养

将B组鱼丸分别在第1、3、5、7、9天进行取样，每次取一袋，加入90 mL无菌水，均质后制成10-1稀释液，然后进行10倍系列梯度稀释[7]。选择适宜的稀释液混匀后分别取1 mL加入无菌平皿，后倒入无菌营养琼脂（NA）20 mL，混匀，冷却凝固后，将平皿倒置于培养箱中，30℃培养（72±2）h。

1.2.3.2 菌株种类的鉴定

观察在NA培养基上分离得到的菌落的特征，挑取具有不同典型形态特征的菌落，分别进行分离纯化，以获得纯种，后保存在试管斜面中，备用。

参照Bagge-Ravn等[8]的方法以及《常见细菌系统鉴定手册》[9]对分离得到的纯种进行鉴定。

1.2.4 高通量测序分析方法

1.2.4.1 DNA提取和PCR扩增

将分组鱼丸按不同时间分别取样约10 g，放入灭菌袋中，磨碎，在超净工作台中加入90 mL生理盐水于灭菌的锥形瓶中，振荡30 min。将得到的浑浊液转移到离心管中，于4℃下以4 000 r/min离心10 min，去上清液于离心管中，继续于4℃下以1 000 r/min离心20min，将沉淀转移EP管中，并于-20℃下保存[10-11]。

PCR反应体系为50μL，包括：2μL DNA模板、1μL正向引物、1μL反向引物、25μL 2xTap MasterMix、21μL dd H2O。PCR反应过程：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min，1个循环。正向引物8F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’）和1541R（5’-AAG GAGGTGATCCAACCGCA-3’）。

1.2.4.2 测序数据处理

委托生工生物（上海）股份有限公司对以上样品进行宏基因组微生物分类测序。

对IIIumina HiSeq测定溱潼鱼丸中微生物群落的结果进行分析，去除3’端引物接头序列，根据PE reads之间的overlap关系将成对reads拼接成一条序列，根据各样本barcode序列从融合后数据中分割出样本数据，去除各样本中reads尾部质量值在20以下的碱基，切除reads中含N部分序列，并去除数据中的短序列，长度阈值200 bp，最后再对低复杂的序列进行过滤，去除嵌合体及非特异性扩增序列，得到有效数据。

1.2.4.3 操作分类单元（Operational taxonomic units，OTUs）聚类和物种注释

利用Usearch软件[12]对“1.2.4.2”得到的序列按照序列间的距离进行聚类操作。将所测得序列在97%相似水平下聚类为不同的操作分类单元（OTUs），进行生物信息统计分析。

2 结果与分析

2.1 传统纯培养分离鉴定结果分析

采用营养琼脂培养基对各样品中可以培养的微生物进行了分离与纯化，通过选取菌落形态各异的菌株共获得37株菌株，经革兰氏染色、形态学鉴定、生理生化鉴定等进行初步分类鉴定，结果见表1。由表1可以看出，假单胞菌属在所鉴定菌株总数中占比较高（45.9%），葡萄球菌属、嗜冷杆菌属、微球菌属和芽孢杆菌属也占有一定比例。传统纯培养分离鉴定的方法受环境培养条件影响较大，往往不能鉴定出冷藏鱼丸中的所有微生物种类，且该方法一般耗时较长，各种鱼糜制品附着微生物群落组成差异不尽相同。

2.2 高通量测序结果

2.2.1 OTU物种注释

本研究通过采用Illumina Hiseq测定B组鱼丸样本得到原始序列条数259 438个，过滤掉低质量序列后，有效序列总数为253 397个。根据Barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，对各样本数据的质量进行质控过滤得到有效数据，并在97%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTUs，得到溱潼鱼丸中群落结果组成，并统计得到各个样品在不同OTUs中丰度信息（序列数）。

采用Krona软件对B1样品中所附着的细菌OTUs进行物种注释，结果如图1所示。共鉴定出21个门，39个纲，49个目，49个科，52个属。图1中由最内圈向外依次分别代表溱潼鱼丸中附着细菌在界、门、纲、目、科、属水平下的物种组成，不同颜色的扇形代表不同菌属，扇形面积的大小代表不同OTUs注释结果的相对比例。

从图1中可以看出：鱼丸中微生物种类在门水平上，以变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）为主，分别占46%和31%；在纲水平上群落组成，变形菌纲（Gammaproteobacteria）属于优势菌纲，占37%；放线菌纲（Actinobacteria）次之，占31%；在目水平上群落组成，假单胞目（Pseudomonadales）占33%；放线菌目（Actinomycetales）次之，占31%；在科水平上群落组成，优势菌科为微球菌科（Micrococcineae）占31%，其次为莫拉式菌科（Moraxellaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae），分别占18%和15%；在属水平群落组成，假单胞菌属（Pseudomonas）是绝对优势菌属，占15%；其余主要菌属为考克氏菌属（Kocuria）占12%，皮生球菌属（Dermacoccus）占11%，水栖菌属（Enhydrobacter）占11%，链球菌属（Streptococcus）占5%，嗜冷杆菌属（Psychrobacter）占5%，乳球菌属（Lactcoccus）占4%，葡萄球菌属（Staphylococcus）占3%。

图1 物种注释结果Fig.1 Species annotation results

2.2.2 分类与系统进化关系

通过使用GraPhIAn和iTOL软件，选择丰度排名靠前的20个菌属（以字母A～T进行表示）所对应的OTUs数据，构建分类与系统发育图（图2）。图中显示最里圈为代表序列所构建的系统发育树，分别用不同的颜色代表不同的菌属，其中系统发育树中圈和星号的大小代表菌属丰度大小。第2层为外围热力图，每一环代表不同的样本，OTUs的相对丰度分布由颜色深浅变化表示；第3层是OTUs注释可信度分布，柱子的高度表示其可信度。

由图2可以看出，嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）相对丰度较高，同时两种菌属在系统进化关系上也很接近。大量研究表明，嗜冷杆菌属（Psychrobacter）是典型的耐寒性细菌，主要是水产鱼类表面的优势腐败菌，在很多水产加工制品和冷藏肉类调理食品中，嗜冷杆菌属仍然是其主要的优势腐败菌[13-15]。

图2 鱼丸样品OTUs的系统发育关系图Fig.2 Phylogenetic relationshipsof OTUs fromfish balls

假单胞菌（Pseudomonas）也具有一定的耐冷特性，冷藏条件下也是肉类腐败过程中最主要的腐败菌之一，当假单胞菌的菌数达到一定水平，就会导致肉品产生异味[16-17]。

2.2.3 溱潼鱼丸样本聚类树图分析

通过样本聚类树图可以直观看出溱潼鱼丸多个样品间的相似性和差异性，结果如图3所示。A组样品经过室温增菌后进行菌属分析检测，从鱼丸中所具有微生物菌属种类数量来看与B组（未增菌组）相差并不大，但随着储藏时间的延长，其中主要菌属所占比例变化较大，尤其是假单胞菌属（Pseudomonas）比例大幅度增加，说明在室温下假单胞菌属（Pseudomonas）在溱潼鱼丸中的生长繁殖速度远快于其他菌属。而B组样品随着时间的延长，其菌属的种类逐渐趋于单一，说明在4℃低温下，嗜冷性或耐冷性的菌属逐渐适应了环境在溱潼鱼丸中逐渐占有优势，其中假单胞菌属（Pseudomonas）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）几乎呈交替上升的趋势，从而对其他菌属的生长造成了一定的影响。随着冷藏时间的延长，B7与B3、B5样品中的微生物细菌菌群的相似性有所降低，说明了储藏时间的延长对鱼丸种菌落组成的相似发生了变化，这对鱼丸中细菌微生物的菌群组成具有一定的影响。

图3 属水平上所有样本聚类树与柱状图组合分析图Fig.3 The combined analysischart of clustering tree and histogramfor all samples at genuslevel

2.2.4 样品的多样性指数分析

溱潼鱼丸中微生物群落的丰度和多样性可以由样本多样性指数反映。Coverage代表各样本文库覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测的概率越高。由表2结果可知，所有样本的覆盖率均在0.99以上，说明本次测序检测对样本中细菌的覆盖率很高，测序深度合适，可满足样品中细菌的多样性分析需要[18]。

表2 各样品的多样性指数Table 2 Diversity index of each sample

Ace和Chao1指数主要反映样品菌样丰度，Shannon和Simpson则反映样品群落多样性[19]。从A组数据可以看出，随着储藏时间的延长，A3样品的Shannon值升高，Simpson值降低，说明其样品群落的多样性在增加，经过室温增菌培养后，鱼丸中的微生物菌群种类在增加；B组样品中，在低温储藏最初阶段，Shannon值较高，Simpson值较低，说明其菌群多样性较高，但随着储藏时间的延长，菌样的多样性有所降低，其原因可能是低温作用抑制了部分微生物的生长与繁殖，致使鱼丸中微生物结构发生了变化，而其菌样的丰度增加主要出现在鱼丸中的主要腐败菌。

3 讨论与结论

通过以上试验可以看出，传统纯培养分离鉴定的方法和高通量测序法虽然都能分析出假单胞菌属（Pseudomonas）在溱潼鱼丸微生物菌群中占有较大比例，但所占比例有一定差异。本试验中，虽然传统分离法较容易操作，但分离出的微生物种类的数量远低于高通量测序法，且传统培养方法因为样本数量和培养条件的限制，所分离出的菌属种类不能完全反映出鱼丸中微生物菌群的种类及比例，尤其传统纯培养分离鉴定对于溱潼鱼丸储藏初期比例（丰度）较小的菌属分离鉴定有一定偏差，而高通量测序法对其中主要微生物菌群及动态变化均能有较为详细的呈现。高通量测序除了鉴定出鱼丸中绝对优势菌是假单胞菌属，还揭示了溱潼鱼丸中菌群的演替规律，假单胞菌属（Pseudomonas）是溱潼鱼丸储藏初期的绝对优势菌属，除此之外，水栖菌属（Enhydrobacter）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）等也占有一定比例。但随着储藏时间的延长，至储藏第7天时，嗜冷杆菌属（Psychrobacter）的数量逐渐占有优势，其与假单胞菌属（Pseudomonas）均成为冷藏鱼丸中的优势菌。这与仪淑敏等[20]通过PCR-DGGE法研究发现鱼糜制品中优势腐败菌可能是嗜冷杆菌的研究结果相近。

针对以上结果推测如果在溱潼鱼丸储藏前期通过对假单胞菌属（Pseudomonas）进行减菌化处理，同时采取有效措施控制嗜冷杆菌属（Psychrobacter）的生长繁殖速度，将有助于改善溱潼鱼丸的品质，延长其货架期。