丹红化瘀口服液中丹参素钠及柚皮苷质量研究

冯月娥 唐 清 匡艳辉＊ 张传平

(广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东 广州510515)

丹红化瘀口服液由成都中医药大学陈达夫教授根据王清任的“血府逐瘀汤”加减化裁研制而成，现行标准收载于2015年版《中国药典》一部，为广州白云山和记黄埔中药有限公司的独家品种，由丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡、枳壳7味药组成的复方制剂。7味药配伍使用，具有活血化瘀，行气通络的功效；用于气滞血瘀引起的视物不清、突然不见症，视网膜中央静脉阻塞症的吸收期见上述证候者[1-3]。

经查阅相关文献，丹红化瘀口服液对糖尿病并发的视网膜病变有较好的保护作用，近几年对其研究集中于临床应用方面[3-7]，而无检索出对其质量控制研究，目前对于丹红化瘀口服液质量标准的研究基础较为薄弱。通过本课题组前期药效学研究，在大鼠血浆中得到丹红化瘀口服液的外源性化合物，其中主要为丹参中丹参素钠等酚酸类和枳壳中柚皮苷、新橙皮苷等黄酮类两大类指标，他们可能是复方潜在真正的活性成分。

目前，该制剂的质量控制方法主要为对薄层色谱法鉴别和原儿茶醛的含量测定[1]，而通过前期试验数据分析得出，原儿茶醛在该制剂中极不稳定，在药品有效期内降解较快，不适宜作为质量指标；另有学者研究柑橘属中很多植物果中均含有柚皮苷，但是不含有新橙皮苷，不能准确判定枳壳质量[8]。因此，本文采用HPLC法对制剂中丹参素钠、柚皮苷含量进行测定，提高了质量可控性，为其质量标准提高提供依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪：Dionex UltiMate 3000（美国戴安公司）、Waters 2695（美国沃特世公司）；色谱柱：WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Aglient Eclipse Plus C18。对照品丹参素钠（批号：5781，纯度97.5%）、柚皮苷（批号：5562，纯度96.0%）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。色谱甲醇、乙腈购自默克（德国）制药公司；屈臣氏饮用水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司；其他试剂均为分析纯。丹红化瘀口服液（批号为B19A001、B19A005、A19A002、D17A003、I19A007、K1 9A003、K19A004）均由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

丹参素钠：采用WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，以甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶92）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长281 nm，柱温为常温，进样量10μL。

柚皮苷：采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，以乙腈-0.4%磷酸水溶液（18∶82）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长284 nm，柱温为常温，进样量10μL。

2.2 对照品溶液制备

丹参素钠：取丹参素钠适量，精密称定，加80%甲醇制成每1 ml含0.560 2 mg的溶液，即得。

柚皮苷：取柚皮苷适量，精密称定，加80%甲醇制成每1 ml含0.2 284 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备

精密量取本品1 mL置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，使每1 mL溶液中含有0.1 mL本品，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液制备

按丹红化瘀口服液处方要求，分别制备不含丹参的阴性样品、不含枳壳的阴性样品，按“2.3”项下方法分别制备丹参阴性对照溶液、枳壳阴性对照溶液。

2.5 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、丹参阴性对照溶液、枳壳阴性对照溶液各10μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图（见图1）。结果显示，分离度良好，丹红化瘀口服液中其他成分对2种指标成分的测定无干扰专属性良好。

图1 丹红化瘀口服液中2种成分HPLC图

2.6 线性关系考察

分别精密吸取“2.2”项下的对照品溶液0.5μL、1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、15μl，注入液相色谱仪中，按“2.1”的色谱条件测定。以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘图得丹参素钠、柚皮苷回归方程，结果见表1。

表1 2种成分线性关系考察结果

2.7 耐用性试验

根据预实验，分别用Dionex UltiMate 3000、Waters 2695高效液相色谱仪和WondaSil C18、Aglient Eclipse Plus C18、Diamonsil C18不同型号的色谱柱对供试品溶液进样分析，结果表明不同仪器和色谱柱分离效果均无明显差异，系统耐用性良好。

2.8 精密度试验

取“2.3”项下制备的供试品溶液，按“2.1”的色谱条件，连续6次进样，结果丹参素钠、柚皮苷峰面积的RSD分别为0.83%、0.23%，表明方法精密度良好。

2.9 重复性试验

取同一份样品，按“2.3”项下平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下的色谱条件测定，结果丹参素钠、柚皮苷平均含量的RSD分别为0.87%、0.83%，表明该方法重复性良好。

2.10 稳定性试验

取“2.3”项下制备的供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h、48 h进样，按“2.1”的色谱条件测定，记录峰面积，结果丹参素钠、柚皮苷峰面积的RSD分别为3.15%、1.33%，表明该方法稳定性良好。

2.11 加样回收率试验

取已知含量同一批丹红化瘀口服液共6份，分别精密加入适量对照品溶液，按“2.3”项下制备的供试品溶液，按“2.1”的色谱条件测定，计算丹参素钠、柚皮苷的回收率。结果丹参素钠、柚皮苷的平均回收率分别为95.07%、105.11%，RSD分别为0.74%、0.88%，（n=6）。结果见表2，表明该方法的准确度良好。

表2 丹红化瘀口服液中2种成分加样回收率试验结果

2.12 样品含量测定

取丹红化瘀口服液样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算样品中丹参素钠、柚皮苷含量，结果见表3。

表3 丹红化瘀口服液中2种成分含量

3 讨论

3.1 指标成分选择

中药制剂组分较多，其制备工艺繁杂，使其质量难以得到较好的控制[9-10]。2015版《中国药典》对丹红化瘀口服液含量检查为原儿茶醛，但通过前期实验发现原儿茶醛在储存期间，含量不稳定，呈下降趋势，时间越久，含量越低；另外，前期药效学研究发现，丹红化瘀口服液中主要的药效成分为丹参素钠等酚酸类和柚皮苷等黄酮类两大指标性成分。因此，选择丹参素钠和柚皮苷作为丹红化瘀口服液指标性成分进行分析。

3.2 提取剂的选择

根据预实验，分别对不同溶剂（水、甲醇、80%甲醇、乙醇）进行考察，综合考虑所得色谱峰的峰面积、分离度、峰形和供试品制备时溶液是否产生絮状物沉淀等方面，最终确定80%甲醇为提取溶剂。

3.3 检测波长的选择

根据不同成分在紫外光下的吸收情况，本实验选择最大吸收波长以避免其他物质干扰，保证测定准确性，最终确定丹参素钠和柚皮苷检测波长分别为281 nm（丹参素钠）、284 nm（柚皮苷），此时色谱峰分离度、峰形理想，可用于定量分析。

3.4 流动相的选择

本次研究为单一成分定量考察，考虑到梯度洗脱比等度洗脱方法的建立和日常应用更为复杂、困难，基线容易发生漂移等，选择了等度洗脱。通过考察了不同比例甲醇/乙腈-磷酸水/甲酸水缓冲液系统，最终丹参素钠、柚皮苷分别选择甲醇-0.5%甲酸溶液（8∶92）、乙腈-0.4%磷酸水（18∶82）作为流动相，此时色谱峰分离度、峰形均良好。

4 结语

本实验建立了HPLC法测定丹红化瘀口服液中丹参素钠、柚皮苷的含有量，该方法简便快捷、重复性好、准确度高，能够有效地提高丹红化瘀口服液质量可控性，建议用于丹红化瘀口服液的含量测定，为其质量标准提高和完善提供科学依据。