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重组酶聚合酶扩增技术在植物病原快速检测中的应用

2021-06-29马文娣田逸英焦志远周涛范在丰

植物保护 2021年3期
关键词:检测

马文娣 田逸英 焦志远 周涛 范在丰

摘要 :植物病原的快速检测对于植物病害防控具有重要意义。 重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)是近年建立的等温核酸扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、适用于现场快速检测等特点,已在多个领域广泛应用。本文对重组酶聚合酶扩增技术的原理、特性、检测方法及其在植物病原体检测领域的应用进展加以综述。

关键词 :重组酶聚合酶扩增; 植物病原; 检测

中图分类号:

S 474

文献标识码: A

DOI: 10.16688/j.zwbh.2020038

Recombinase polymerase amplification and its applications in

quick detection of plant pathogens

MA Wendi, TIAN Yiying, JIAO Zhiyuan, ZHOU Tao, FAN Zaifeng*

(Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

Abstract

The rapid diagnosis of plant pathogens is essential for efficient prevention and control of plant diseases. Recombinase polymerase amplification (RPA) is an isothermal nucleic acid amplification technology developed in recent years, which has been widely applied in many fields. It is suitable for on-site rapid detection with high sensitivity and strong specificity. In this paper, we review the principles, characteristics, detection methods of RPA and its applications in the detection of plant pathogens.

Key words

recombinase polymerase amplification; plant pathogen; detection

病原物的准确检测和鉴定是植物病害防控策略中的关键环节。20世纪80年代以来,随着聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)等分子生物学技术的迅速发展,核酸检测技术凭借其快速、灵敏、特异性强的特点被广泛应用于病原物检测与鉴定领域。然而,传统PCR对精密温控设备的依赖性较高,需要PCR热循环仪完成预变性、变性、退火及延伸等步骤,且反应耗时长,难以满足经济、高效的检测需求。

近年来,等温扩增技术逐渐发展成熟,与传统PCR相比,其无需热循环等步骤,反应温度单一,扩增反应更为迅速;如环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术[1],可以在较低的恒定温度下完成核酸的快速扩增,具有检测周期短、操作便捷、对精密温控设备的依赖程度低等显著优势。

2006年,Piepenburg等建立了由多种酶和蛋白质参与的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术[2]。RPA技术扩增速度快,特异性强,灵敏度高,对环境条件要求较低,将扩增体系与其他检测技术结合,可以不再依赖精密的仪器设备,适用于病原物快速檢测及病害诊断,因此受到了广泛关注。

1 RPA技术概述

1.1 反应原理

RPA技术是仿照T4噬菌体DNA的复制机制,在体外实现目的基因片段的恒温扩增[2]。RPA扩增主要依赖于3种组分:来自T4噬菌体的重组酶uvsX及其装载辅助因子uvsY[3]、单链DNA结合蛋白(gp32)以及来自枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis的链置换DNA聚合酶Ι大片段即Bsu DNA聚合酶。在25~43℃区间内的任一恒定温度条件下,持续5~20 min即可完成核酸扩增反应[48]。

在ATP的作用下,能结合单链核苷酸的重组酶uvsX与寡核苷酸引物结合,形成蛋白寡核苷酸复合体。复合体通过双向扫描双链DNA,定位到与引物序列同源的靶序列;一旦定位到目标位点,重组酶可直接打开靶序列双链DNA,并完成引物与同源序列的链置换反应形成D-loop结构[9]。单链结合蛋白与被引物置换的母链结合稳定其结构,防止置换的单链被替换,使模板双链呈打开状态。与此同时,蛋白寡核苷酸复合体主动水解反应体系中的ATP,使复合物构象改变,重组酶uvsX与引物解离,引物3′端暴露后迅速被链置换Bsu DNA聚合酶识别,启动链的延伸,形成新的互补链。新合成的单链与原始互补链配对,最终形成一个完整的扩增子。新合成的扩增子作为模板,不断循环重复扩增过程,实现核酸的指数级扩增。同时,体系中的辅助因子uvsY能够促进uvsX与引物单链DNA的紧密结合,进而加快扩增反应[2]。若在反应体系中加入反转录酶首先进行反转录就可以检测样品中的RNA分子[7]。

1.2 引物设计

RPA引物的设计是重组酶聚合酶等温扩增技术的核心。引物设计应基于特异性强的靶标序列[10]。RPA扩增的片段长度理论上可以达到1.5 kb, 但当目的基因片段长度在100~200 bp时,可以提高扩增的灵敏度和特异性,达到最佳扩增效果[2]。RPA引物最佳长度为30~35 nt。引物过长易产生二级结构,过短会降低扩增反应的重组率,影响扩增反应速率。单个引物应避免出现连续重复序列、回文序列及发卡结构。设计引物时,应避免引物之间互补形成二聚体。

1.3 RPA扩增产物检测方法

1.3.1 凝胶电泳检测

通常采用琼脂糖凝胶电泳对RPA基础反应体系的扩增产物进行检测。RPA基础反应体系相较于传统PCR体系,添加了多种酶和蛋白质,为了避免反应体系中引物、酶等组分干扰凝胶电泳,出现拖尾现象,扩增产物需用酚氯仿纯化后再进行琼脂糖凝胶电泳[11]。经溴化乙锭染色后,紫外灯下(紫外线波长365 nm)进行检测。

1.3.2 实时荧光定量检测

实时荧光定量RPA(real-time RPA)是在RPA基础反应体系中加入核酸外切酶Ⅲ(exonuclease Ⅲ,即exo)和特异性荧光标记的exo探针。exo探针包含一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团,

分别结合在极为接近的胸腺嘧啶上(仅相隔1~5个核苷酸),两荧光基团中间位置设计有一个四氢呋喃(THF)残基。

在探针3′末端需要添加一个合适的阻隔基团,以阻断链的延伸。当该结构保持完整时,体系内的荧光强度很低。当探针与目的序列结合时,THF位点被核酸外切酶Ⅲ识别并剪切,荧光报告基团与荧光淬灭基团分离,扩增产物与荧光信号同步积累,可以通过检测荧光信号强度实时监测目的基因片段的扩增情况[2]。

1.3.3 侧流层析试纸条检测

侧流层析试纸条RPA(lateral flow dipstick-RPA,LFD-RPA)方法原理[1]是带有生物素修饰引物的核酸扩增产物可以和带羧基荧光素(FAM)标记的特异探针杂交,使扩增产物同时携带FAM和生物素双标记。该技术在RPA基础反应体系的基础上,加入核酸内切酶Ⅳ(endonuclease Ⅳ,即 nfo)、nfo探针和3′端带有生物素标记的反向引物。nfo探针5′端带有一个FAM荧光基团,3′端带有一个阻隔基团,在中间位置带有一个THF位点。仅当探针结合时,THF位点才能被核酸内切酶Ⅳ裂解,产生的3′端羟基是聚合酶结合的位点,启动链的延伸,使5′端FAM标记和3′端生物素标记能够整合到扩增产物中。

侧流层析试纸条的前端有一条质控线,包被有固定抗体,质控线下端有一条检测线,包被有生物素配体。为避免反应底物对试纸条上的抗体检测形成干扰,通常将稀释后的反应液滴加到试纸条上,检测线上的生物素配体可以结合带有生物素标记的扩增产物并显色,扩增产物中的FAM标记可以与质控线包被的固定抗体结合呈现颜色,以确保试纸条的有效性。

2 RPA技术在植物病原检测方面的应用

RPA作为一种新型核酸等温扩增技术,自建立以来凭借高灵敏度、高特异性,操作简单等优势已经逐步应用于生命科学、食品安全、生物安全等领域。近年来,RPA技术已应用于植物病原物的快速检测与鉴定。

2.1 RPA在菌物检测方面的应用

在农业生产中,70%~80%的植物病害是由病原真菌侵染所导致的[12]。病原真菌侵害不仅会造成作物产量下降与品质降低,甚至会产生多种不同类型的真菌毒素和代谢物质,严重威胁食品安全与人畜的生命健康。卵菌包括多种疫霉、霜霉和腐霉,可侵染多种农作物造成毁灭性的病害。因此,应加强对植物真菌和卵菌病害的早期诊断与病原物检测技术研究与应用。

油菜茎基溃疡病是油菜上发生最为严重的真菌病害之一,其致病菌包括致病力较强,能够产生西洛菌素PL(sirodesmin PL)的油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans以及致病力较弱、不产生毒素的油菜黑胫病菌L.biglobosa。Lei等[13]选择ITS区域作为重组酶聚合酶扩增的靶标序列,筛选针对这两种病原菌的特异性RPA引物和探针,利用便携式实时荧光检测仪实现了对甘蓝型油菜茎基溃疡病的两种病原菌的快速检测。本实验室已建立了禾谷镰孢Fusarium graminearum及藤仓镰孢F.fujikuroi的RPA检测体系(待发表)。

疫霉属的植物病原菌可危害多种农作物和森林植物。Miles等[14]选择疫霉属卵菌线粒体基因组中高度保守的trnM-trnP-trnM区域,建立了疫霉属基因组特异性分析的RPA方法;

根据其线粒体基因组atp9-nad9区域中具有的种间序列多态性

建立疫霉菌种间特异性分析的RPA方法。辣椒疫霉Phytophthora capsici是一种重要的病原菌,可侵染多种作物。Yu等[15]基于侧流层析试纸条RPA法,依据Ypt1基因序列设计了特异性引物和探针,测定出最佳试验条件为40℃,20 min,其检出限为10 pg。Ammour等[16]针对马铃薯晚疫病菌的核糖体DNA ITS2 区域设计RPA引物和exo探针,建立了实时荧光定量RPA检测体系。该反应体系在39℃反应30 min,每30 s检测一次荧光强度,RPA检测最低限可以达到50 fg/μL,同时该体系也可以检测近缘种。

2.2 RPA在细菌检测方面的应用

近年来,针对细菌性病害建立的RPA检测体系也有报道,在特异性和灵敏性方面均达到了较好的检测效果。

柑橘黄龙病Huanglongbing是一种严重的细菌性病害,影响着全世界的柑橘产业,并在全球造成数百万的柑橘类植物死亡。Ghosh等[17]針对柑橘黄龙病病原菌Candidatus Liberibacter asiaticus保守的16S rRNA基因设计特异性引物对和探针,以纯化的DNA和植物粗提取物为模板优化扩增温度和反应时间,并结合侧流层析试纸条检测方法建立了简便快速、灵敏的RPA检测体系。

细菌性斑点病是在番茄上广泛发生的重要病害。Strayer-Scherer等[18]选择引起番茄细菌性斑点病的3种不同病原细菌Xanthomonas euvesicatoria、X.gardneri和X.perforans的特异基因hrcN建立了较为完善的实时荧光RPA检测体系,可以实现对一种或多种植物病原细菌的有效鉴定与快速检测。Wambua等[19]基于水稻植原体Candidatus Phytoplasma oryzae的imp基因,建立了适用于现场检测的实时荧光检测体系和侧流层析试纸条检测体系,实现对该病原体的特异性检测。

2.3 RPA在植物病毒检测方面的应用

植物病毒种类繁多,分布广泛,危害严重[20]。因此,建立快速、高效的病毒检测体系对于防控病毒病的发生与流行具有重要意义。

黄瓜绿斑驳花叶病毒Cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV)与玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus(MCMV)均为重要的检疫性病毒。Jiao等[2122]基于CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)和MCMV CP基因的保守序列设计RPA的特异性引物,建立了反转录RPA(reverse transcription-RPA,RT-RPA)检测体系,38℃条件下等温反应30 min左右即可实现最佳扩增效果,比传统反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测的灵敏度约高10倍,该方法已应用于检测田间采集的样品。

Kim等[23]基于苹果茎沟病毒Apple stem grooving virus(ASGV) CP基因高度保守的区域设计特异性引物,扩增反应1~30 min,扩增产物量无显著差异,说明反应1 min后,反应中的脱氧核苷三磷酸(dNTPs)或其他酶活性成分已消耗殆尽。该检测方法具有较高的灵敏度和特异性,反应时间非常快。Babujee等[24]优化了RPA技术,可准确检测马铃薯Y病毒Potato virus Y(PVY)的PVYO和PVYN株系。Babu等[25]基于荧光定量RT-RPA检测方法,依据玫瑰丛簇病毒Rose rosette virus(RRV) 核蛋白N基因设计引物和探针建立的检测体系具有高度特异性和灵敏性,最小检测限度为1 fg/μL。此外,还建立了从不同的RRV侵染组织中快速提取病毒RNA的方法,与荧光定量RT-RPA方法结合可以用于玫瑰丛簇病毒的现场快速检测。

Jiao等[26]基于CRISPR/Cas12a系统建立了多种苹果病毒与类病毒(苹果坏死花叶病毒Apple necrotic mosaic virus, 苹果茎痘病毒Apple stem pitting virus, 苹果茎沟病毒Apple stem grooving virus, 苹果褪绿叶斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus和苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid)的多重核酸检测体系,该体系采用RT-RPA技术直接从粗提取物中检测目标病毒,通过寡聚核苷酸结合的纳米金颗粒,可肉眼区分出阳性结果,且该结果与传统PCR检测结果完全一致,特异性强。这种基于CRISPR/Cas12a的方法用时短,从采集样品开始至多需要1 h即可完成检测,不需要将样品送到专门的实验室即可实现多种病原物的现场检测,便于及时采取防控措施。

Srivastava等[27]基于黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)外壳蛋白基因保守区域,设计用于荧光定量RT-RPA检测的特异性引物对和探针,分别使用紫外线探照器和荧光计直接观察扩增反应产生的荧光信号,验证出便携式检测的荧光定量RT-RPA方法的灵敏度仅略低于RT-RPA,但均高于常规RT-PCR的灵敏度。水稻黑条矮缩病毒Rice black-streaked dwarf virus(RBSDV)主要侵染水稻、玉米和小麦,可导致水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病,造成严重经济损失。Zhao等[28]针对RBSDV病毒的P10外壳蛋白基因,利用RPA扩增结合琼脂糖凝胶电泳检测、实时荧光检测、侧流层析试纸条等多种扩增产物检测方法,建立了简便迅速、高效的水稻黑条矮缩病毒检测体系。本实验室已建立了南方水稻黑条矮缩病毒Southern rice black-streaked dwarf virus(SRBSDV)的RPA检测体系(待发表)。

3 总结与展望

随着分子生物学的不断发展成熟,等温核酸扩增作为PCR的重要分支,因其对加热条件的要求较低,核酸复制速度快,操作简便等技术特点而得到广泛应用[29]。相比环介导等温扩增(LAMP)[1],滚环扩增(rolling-circle amplification)[30],信号介导的RNA扩增技术(signal-mediated amplification of RNA technology)[31],多重链置换扩增(multiple displacement amplification)[32],RPA技术是相对较新的等温扩增技术,凭借其更为简单的引物设计、简洁的扩增方案、反应速度更快,灵敏度高和特异性强的独特优势,不仅在植物病害检测领域得到了普遍应用,在生命科学的其他领域也表现出巨大的潜力[7, 3340],成为近年来广受关注且发展最快的方法之一。

RPA技术目前还存在一些不足之处。例如,所需引物和探针较长(不适用于短序列扩增),缺少专门用于RPA引物和探针设计的软件或网站,以及检测成本较高等。然而,凭借其恒定温度、扩增用时短及操作便捷等优势,RPA技术在生物安全和医学临床等领域的现场检测方面仍具有明显的优势和广阔的应用前景。

随着RPA技术的不断完善,其應用范围将会逐步扩大。首先,RPA基础反应体系中的基本成分重组酶聚合酶是恒温扩增反应的关键酶,通过对该组分的进一步探究,找到价格较低的替代品,可以降低RPA检测成本。其次,通过对基础反应体系进行优化,进一步拓宽反应的温度范围,使RPA摆脱加热设备的限制,实现在自然温度下的快速检测。此外,将RPA方法与简易的核酸提取方法、可视化产物检测方法相结合,有望实现样品处理、快速扩增及可视化产物观测一体化的实时现场检测。通过结合生物传感器、芯片技术等技术手段,可以实现对常见病原的多重检测,显著提高检测效率,满足实际应用需求。另外,通过研发便携式、智能化的RPA快速检测装置,将为在野外或基础设施薄弱的地区实现一体化现场检测提供便利。因此,RPA可作为PCR的辅助手段应用于生物学各领域的核酸分子检测。随着RPA技术的不断发展与完善,在未来将逐步实现操作简捷、反应迅速的一体化实时现场检测,为生物安全、植物保护等领域提供有力的技术工具。

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(責任编辑:杨明丽)

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