棘孢木霉M45a 的定殖能力及其对水稻促生作用研究

张 屹，何 英，肖姬玲，魏 林，田 云，梁志怀*

(1. 湖南省农业生物技术研究所，长沙 410125；2. 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；3. 湖南省植物保护研究所，长沙 410125)

木霉菌（Trichodermaspp.）能广泛存在于土壤和植物组织中，具有适应性强、生长繁殖快等特点[1]，能和植物体形成共生，具有诱导植物抗性和促进植物生长的作用[2-3]。因此，许多木霉菌已被成功开发为微生物肥料和微生物农药，形成巨大的市场应用前景[4]。

目前，木霉菌已经被证明对玉米、小麦、黄瓜和花生等旱地栽培作物的生长具有明显促进作用，对作物根系的促生效果更为显著[5-9]。水稻作为重要的粮食作物，李松鹏等[2]报道哈茨木霉菌株3S1-13和4S2-46 发酵液处理后的水稻种子发芽率和幼苗的根系、鲜重均显著高于对照，显示出有利于促进种子发芽与生长的作用。同时大量研究也表明，木霉菌具有很强的根际定殖能力，在土壤及根系表面快速生长，并能伴随根系的生长而拓展[10-11]。而李进一等[12]利用植物组织培养基培养观察发现短密木霉新菌株BF06 可以迅速附着定殖于黄瓜根部表面，显著地促进幼苗黄瓜侧根的形成和生长。

虽然关于高效生防与促生的木霉菌剂及其机制报道比较多，但是木霉菌在水稻根系中的定殖规律及田间施用促生效果还鲜见报道。前期实验室通过EMS 诱变技术获得一株具有恶霉灵耐性和拮抗作用的棘孢木霉（Trichoderma asperellumM45a）M45a，研究表明其分生孢子悬浮液对水稻幼苗有显著的促生长作用。因此，本研究利用棘孢木霉M45a对水稻的处理以及定殖效果，进一步验证其对水稻田间的促生作用，指导木霉菌剂产业化和制定科学田间施用技术，以期为开发棘孢木霉菌肥及减少水稻种植中化肥施用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株与水稻品种 供试菌株棘孢木霉M45a 以及含GFP 基因标记菌株M45a-GFP，由湖南省农业生物技术研究所提供；供试水稻种子Y 两优2 号，由国家杂交水稻研究中心提供。

1.1.2 培养基 PDA培养基包括新鲜马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g 和水1 L，pH 自然；PD 液体培养基为不加琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 棘孢木霉M45a 孢子悬浮液的制备 将保存的棘孢木霉菌株活化，PDA 培养基培养7 d，在无菌条件下，加无菌水制成分生孢子悬浮液原液，4层灭菌的擦镜纸过滤并涡旋震荡，血球计数板计数调整浓度为1×105cfu·mL-1孢子液。

1.2.2 棘孢木霉M45a 在水稻根系的定殖 采用浸种处理方式接种GFP 标记菌株M45a-GFP，出芽后播种于灭菌沙土中，28 ℃，14 h 光照和25 ℃，10 h 黑暗交替培养。其中移栽7 d 期间，每隔 24 h 取水稻根系组织，徒手切片，以激光共聚焦扫描显微镜观察菌株在水稻根系中的定殖情况。

1.2.3 棘孢木霉M45a 的盆栽促生效果 选取150粒饱满一致的水稻种子置于55℃温水中浸泡18 h，置于1×105cfu·mL-1M45a 的孢子悬浮液或者清水溶液中浸泡5 h；将浸种后的种子，用蒸馏水冲洗3次后，均匀置于垫有3 层滤纸的培养皿中（直径10 cm），5 mL 上述M45a 孢悬液或者清水喷撒种子。28℃条件下催芽后，播于含15 kg 水稻田土壤移栽盆中，每盆30 粒，30 d 后取苗，测量其株高、根长、分蘖数、总株鲜质量和总株干质量，3 次重复。具体处理如表1。

1.2.4 棘孢木霉M45a 浸种对水稻田间促生效果

（1） 研究区域概况。试验于2019 年在湖南省黄兴镇试验田进行。试验地点属亚热带季风湿润气候，年平均气温 17.7°C，无霜期为 282 d，全年平均雨量 1 587 mm，最高和最低月平均气温分别为7 月（29.8°C）和 1 月（5.1°C）。

表1 水稻种子不同处理方式情况Table 1 Different treatments of rice seeds

（2）试验设计。试验共设2 个处理，其中浸种处理参照1.2.3 方案，以清水为空白对照，采取水稻种子直播方式撒播于小区地，每个处理设置 3 次重复，随机区组排列，小区面积 20 m2；各小区间使用隔水板隔开，隔水板置于泥土底下深埋高度为 40 cm，置于地面起垄高度为20 cm，以达到小区相对独立的环境；另外，田间小区的水分、植保、施肥等管理措施与当地农民习惯保持一致。

（3）植物样品采集与测定。利用5 点取样法分别取水稻分蘖期（生长30 d、40 d 和50 d）10 株成苗和根际土壤样品，测量其株高、地上部分鲜（干）质量和根际土壤氮含量；对成熟期水稻测量其单株穗粒数、千粒质量等产量指标。

土壤总氮含量采用重铬酸钾-硫酸消化法测定[13]，土壤硝态氮含量、铵态氮含量分别采用酚二磺酸比色法、 KCl 浸提-靛酚蓝比色法测定[14]。

1.2.5 数据分析

采用Excel 2007 进行平均值和标准差的计算；采用SPSS 25.0 软件进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 木霉菌M45a 在水稻根系中的定殖

通过取样切片荧光显微观察，在接种M45a-GFP 后的1 d，M45a-GFP 的孢子能稳定聚集在根表皮，见图 1（a）；3 d 后，GFP 标记菌株孢子萌发菌丝，附着于水稻根表皮，见图 1（b），同时部分菌丝穿透皮层细胞在主根韧皮部定殖，见图1（c）；7 d 后，侵入侧根表层，进入维管束和细胞间隙，并能在水稻根系中定殖、产孢，见图1（d）。从15 d 到30 d 后，水稻根系组织中仍然可以观察到绿色荧光菌丝。上述结果表明，通过水稻浸种接种，GFP 标记的木霉菌株能够在水稻根系组织中定殖。

图1 GFP 标记菌株M45a-GFP 在水稻根系中的定殖Figure 1 Colonization of the GFP labelled strain M45a-GFP in the rice roots

2.2 M45a 不同施用方式对盆栽水稻苗期的影响

由表1 可知，不同处理的植株均健康生长，接种M45a 的水稻植株生物量高于清水处理（对照）。与对照相比，经过M45a 浸种处理的水稻植株，其根长、株高、分蘖数、总株鲜质量和总株干质量分别增加了 29.3%、16.5%、160.36%、114.29%和140.7%，呈差异显著；而棘孢木霉M45a 拌种处理的水稻植株与对照没有形成显著性差异。因此，选择M45a 孢子浓度 1×105cfu·mL-1浸种为水稻合适的处理方式。

2.3 M45a 浸种对大田水稻生长的影响

进一步分析M45a 浸种对大田水稻生长的影响（图2），结果显示，在不同生长时期， M45a 浸种处理的水稻植株生物量稍高于空白对照；特别是在水稻生长50 d （T3）时，与对照相比，M45a 浸种处理的水稻植株在株高、地上部鲜质量及地上部干质量方面分别增加8.1%、23.3%和10.0%。因此，说明接种M45a 水稻植株与对照相比，在生长的各方面都有显著的促生优势。

2.4 M45a 浸种对大田水稻根际土壤氮含量的影响

与对照比较，M45a 对水稻根际土壤氮含量及氮转化有着一定促进作用。在水稻播种40 d（T2），水稻根际土壤中总氮含量和硝态氮含量达到了显著差异，分别提高了16.8%和25.75%，为水稻分蘖最为旺盛的前中期提供足够的氮素；而到分蘖后期（T3），M45a 水稻根际土壤中总氮含量和硝态氮分别提高了14.92%和22.34%，依然保持较高的土壤氮素含量，持续诱导分蘖产生（图3）。

表2 不同处理下棘孢木霉对水稻幼苗生长的影响Table 2 The growth of rice in seedling under different treatments of Trichoderma asperellum

图2 M45a 浸种对大田水稻生长的影响Figure 2 The rice growth of germinated seeds by M45a in field

图3 M45a 浸种对水稻根际土壤氮含量的影响Figure 3 The nitrogen contents of rhizosphere soil of germinated seeds by M45a in field

表3 M45a 浸种对大田水稻产量指标的影响Table 3 Effect of rice yield index of germinated seeds by M45a in field

2.5 M45a 浸种对大田水稻产量指标的影响

从表 3 可看出，M45a 浸种显著提高了水稻单穗穗粒数和千粒质量，但有效穗数的差异不显著。与CK 处理相比，穗粒数和千粒质量促进率分别在9.88%和5.15%以上。本试验利用棘孢木霉M45a 浸种处理提高了每穗粒数和千粒质量；与此同时也提高根际土壤氮含量在一定程度上影响水稻的产量指标。

3 讨论

木霉菌（Trichodermaspp.）是国际上应用非常普遍的生防真菌，除用于防治各类植物的土传病害和部分叶部和穗部病害，增强植物抗逆性和修复农化污染的环境。目前，国内在木霉菌对植物促生作用方面的研究比较多，哈茨木霉[15]、长枝木霉[16]和钩状木霉[17]等均对作物有一定的促生作用。前期研究发现哈茨木霉TUV-13 能在水稻秧苗的根、茎和叶中稳定定殖和提高水稻抗纹枯病作用[18]。因此，本研究进一步利用筛选出耐药性好的生防棘孢木霉M45a 以探讨对水稻的促生效应，结果显示M45a 浸种水稻种子的幼苗促生效果明显优于拌种和对照，可以有效应用于水稻大田生产中，实现菌肥和化肥优势互补，减少化肥的用量。

在自然环境下，生防微生物能否稳定生存并有效定殖于作物各组织中是发挥其生物防效的重要条件[19]。通过绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）标记技术能够实时、动态地研究微生物的空间定位、微生物与环境及宿主之间的互作[20]。已有研究报道，木霉菌能定殖于植株根部与植株共生，促进植株生长和抗病性[21]。本研究所选用的GFP 标记的木霉菌株M45a-GFP 能侵入水稻根系内部并稳定定殖，经过7 d 后，木霉菌菌丝在水稻根系表面和组织内部形成类网状结构，部分菌丝开始产孢。而且第30 天后仍然能看到带绿色荧光的菌丝分布于根系周围，这与赵兴丽等[17]、田程等[22]的研究结果相一致。这说明M45a-GFP 在水稻根系组织有很好的生存能力，为棘孢木霉M45a 对生防促生作用提供了支撑。

氮肥作为仅次于水的重要影响因素，对水稻产量有着巨大影响。然而，有益微生物在植物根际定殖后，其分泌的次级代谢物质可以增加其固氮、解磷和溶钾的能力，进而促进植物根系生长[23]。研究表明，木霉菌通过分泌多种植物生长激素（IAA、CTK、GA3）、提高土壤养分利用率、增强根际定殖能力等机制来发挥促生作用[24]。其中，哈茨木霉H-13 除了可以促进植物对N 的吸收外，还可以显著地促进植物对K 的吸收[25]。本研究利用M45a 浸种处理水稻种子后发现，水稻根际土壤中的总氮和硝态氮含量显著提升。究其原因，初步认为是M45a在水稻根系组织定殖后，分泌了次级代谢产物促进了土壤中有机质的分解和水稻生长，并为水稻分蘖期提供大量的速效氮源，提高水稻的生物量和产量。这些结果充分肯定了对棘孢木霉M45a 在水稻生产应用的可行性，也为木霉菌与水稻之间的互作机制研究奠定了基础。