不同养殖密度下二龄刀鲚消化酶活性与分布特点

刘永士，王建军，朱建明，陆根海，施永海，刘建忠

(上海市水产研究所，上海市水产技术推广站，上海 200433)

鱼类对食物的消化和吸收直接关系其生长、发育和繁殖等生命活动，且消化系统结构决定了鱼类的食性。对鱼类消化系统结构及其相应消化酶活性及分布的研究是认识和探讨鱼类摄食、消化和吸收机制的基础和重要途径[1]。目前，已有关于翘嘴鲌（Culter alburnus）[2]、长鳍篮子鱼（Siganus canaliculatus）[3]、西伯利亚鲟（Acipenser baerii）[4]、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）[5]等的消化道指数及各组织消化酶活性及分布的研究。邓平平等[6]和施永海等[7]分别研究了盐度和不同饲料对刀鲚幼鱼胃、肠和幽门盲囊中消化酶活性的影响，但未涉及消化道指数和肝胰脏消化酶活性的研究。

刀鲚（Coilia nasus）， 属于鲱形目（Clupeiformes），鳀科（Engraulidae），鲚属（Coilia），为江海洄游性鱼类，主要分布于我国黄渤海和东海一带，凡通海的江河均有分布，以长江下游产量最高[8]，近年来，在江湖阻隔、水域污染加剧及长期高强度捕捞等多重影响下，长江刀鲚资源急剧衰退[9]，因此，开展刀鲚的人工养殖是解决刀鲚供求不平衡的重要手段。养殖密度是影响养殖水体生产力的关键因子之一，高密度养殖是提高养殖系统生产力最常用的手段，但目前，人工配合饲料的缺乏是刀鲚规模化养殖发展的关键瓶颈，从研究刀鲚的消化生理入手，是解决这一难题的重要途径之一。当前刀鲚的人工养殖严重依赖活体生物饵料[10-11]，通过培养基础生物饵料以及接种外源生物，是常用的刀鲚养殖手段[10,12-13]，但生物饵料来源不稳定，如果刀鲚养殖密度过高，会导致种内对空间和饵料的竞争加剧，尤其在生物饵料来源不稳定的情况下，势必会导致刀鲚群体生长率和成活率的下降。本试验用浮游动物（枝角类和桡足类等）和日本沼虾作为饵料生物，研究了不同养殖密度下二龄刀鲚的消化道指数（比肠长）和各组织的消化酶活性及分布特点，旨在了解刀鲚的消化生理特点及不同养殖密度下消化生理的适应性变化，丰富了刀鲚的消化生理基础资料，为二龄刀鲚配合饲料的研制及优化养殖技术提供实践与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 池塘条件 养殖池塘位于上海市奉贤区星火农场养殖区域（杭州湾北岸），为相邻的3 口池塘（编号：8#北、8#南、9#北），每口池塘面积为4 亩，水深1.5 m，呈规整的长方形，东西走向，进排水方便，进水口用60 目筛绢网过滤，排水口网眼为2 mm×3 mm 的围网和40 目的闸网。利用网片（网眼为2 mm×3mm）南北向固定于池塘中（底部封土固定，上部高出水面50 cm）将每口池塘均分为4 个围隔，每个围隔面积1 亩，每亩配备1.5 kW 叶轮式增氧机1 台，池塘上方覆盖尼龙网以防止鸟类偷食。池塘使用前，清塘消毒，池底浸泡消毒24 h 后，彻底排干曝晒待用。

1.1.2 试验用鱼和用水 试验用二龄刀鲚为上海市水产研究所奉贤科研基地全人工繁育的刀鲚苗种，经室内强化培育、室外池塘培育、越冬养殖及室外池塘养殖后，于次年4 月份拉网取出，规格为体长（12.63±1.55）cm，体重（4.43±1.25） g，用于本试验研究。试验用水为当地河水，水温18～33.9 ℃，pH 8.08～9.56。

1.2 方法

1.2.1 鱼种放养 鱼种放养前，池塘要提前培养基础饵料生物，根据放养鱼种时间，提前5～7 d 进水，先进水50 cm，后根据水色情况和饵料生物量等逐步添加水至1.5 m 水位，5～7 d 后水色变浓，水体中出现枝角类以及桡足类等饵料生物，待饵料生物量达到20～40 个·L-1，放养二龄刀鲚鱼种。

选择晴好天气在池塘的上风处放苗，提前开启增氧机，使池水不分层，放养鱼种要求规格整齐、鳞片完整且活力较好。

二龄刀鲚养殖设置3 个密度梯度，分别为500尾·亩-1（8#北，组别：A）、1 000 尾·亩-1（8#南，组别：B）、1 500 尾·亩-1（9#北，组别：C），每个养殖密度设3 个平行（即每个池塘仅用上述4 个围隔中的3 个，剩下1 个空置），各密度组刀鲚放养后，暂养7 d，期间每天捞出死鱼并记录，7 d 后根据各试验组死鱼数补入同批二龄刀鲚，之后养殖试验开始计时。

1.2.2 饵料生物投放与管理 除了鱼种放养前培育饵料生物外，在刀鲚放入池塘的7 d 内，陆续向每个试验组中添加小型日本沼虾（Macrobrachium nipponense）作为其饵料生物，后期根据养殖塘内日本沼虾数量，适当补充，养殖周期内，投放日本沼虾的量分别为：A 组10 kg，B 组15 kg、C 组20 kg，每天投喂适量南美白对虾配合饲料作为日本沼虾的饲料。

1.2.3 日常管理 每天晚上开机8～10 h，晴好天气中午开增氧机1 h，天气恶劣时，增加开机时间；每天（8：00、16：00）测水温2 次，养殖期间水温为15.2～31.4 ℃；每14 d 注换水1/3。养殖从4 月份开始到10 月份结束，共189 d。

1.2.4 样品采集、处理及酶液制备 养殖结束后，每个平行取刀鲚5 尾，饥饿24 h，测量体长与体质量（见表1），放入-80 ℃冰箱中保存备用。试验前，从冰箱中取出刀鲚，放入0～4 ℃冰箱中解冻，置于冰盘中解剖，取出肝胰脏、胃、幽门盲囊和肠，量肠长与体长，用生理盐水洗净组织并用滤纸吸干，将组织分别在冰盘中剪碎，搅拌均匀，称取适量组织样本（0.1～0.2 g），放入已事先预冷的玻璃匀浆器中，加入9 倍体积的预冷生理盐水，冰浴匀浆，冷冻离心（0～4 ℃，3 500 r·min-1，10 min），取上清液即刻测定各组织消化酶活性。

消化酶活性测定所用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，并按试剂盒说明书要求操作。

1.2.5 消化酶活性定义 胰蛋白酶活性定义：在pH 8.0，37 ℃条件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003 即为一个酶活力单位，U·mg-1。

胃蛋白酶活性定义：在37 ℃，pH 3.8 条件下，每毫克组织蛋白每分钟分解蛋白生成1 μg 氨基酸相当于一个酶活力单位，U·mg-1。

淀粉酶活性定义：在37 ℃，pH 7.0 条件下，组织中每mg 蛋白与底物作用30 min 后水解10 mg淀粉定义为一个淀粉酶活力单位，U·mg-1。

脂肪酶活力定义：在37℃条件下，每g 组织蛋白在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个酶活力单位，U·g-1。

1.3 数据处理

采用SPSS20 处理数据，用Oneway ANOVA 和Duncan 氏检验法对各组数据进行显著性差异分析和多重比较，P＜0.05 视为差异显著。利用Excel 2016作图。

式中：L为体长（cm），Li为肠长（cm）。

2 结果与分析

2.1 消化道指数

由表1 可知，经过189 d 的养殖，不同密度组二龄刀鲚的体长与体质量存在显著差异。A 组体长（20.26 cm）与体质量（30.74 g）均高于B 组（18.18 cm、21.37 g）和C 组（17.16 cm、19.96 g）（P＜0.05）；3 个组比肠长不存在显著差异。

2.2 胃蛋白酶

3 种养殖密度下刀鲚4 种组织（肝胰脏、胃、肠、幽门盲囊）的胃蛋白酶活性见图1。A 组肝胰脏（2.23 U·mg-1）和胃（7.40 U·mg-1）中胃蛋白酶活性显著高于B 组（0.92 U·mg-1、5.39 U·mg-1）和C 组（0.93 U·mg-1、5.95 U·mg-1）（P ＜0.05），3 个密度组刀鲚肠和幽门盲囊中胃蛋白酶活性差异不显著。

3 种养殖密度下刀鲚胃蛋白酶活性均以胃中最高，且在4 种组织中分布存在差异（图1）。根据显著性检验结果可知，A 组：胃＞肠≈肝胰脏＞幽门盲囊；B 组：胃＞肠＞肝胰脏≈幽门盲囊；C 组：胃＞肠≈幽门盲囊≈肝胰脏。

表1 二龄刀鲚的消化道指数Table 1 The digestive tube index of two-year Coilia nasus

图1 不同养殖密度下二龄刀鲚各组织胃蛋白酶活性Figure 1 Pepsin activity in different tissues of 2-year-old Coilia nasus cultured at different densities

图2 不同养殖密度下二龄刀鲚各组织胰蛋白酶活性Figure 2 Trypsin activity in different tissues of 2-year-old Coilia nasus cultured at different densities

2.3 胰蛋白酶

3 种养殖密度下刀鲚肝胰脏和胃中胰蛋白酶活性差异不显著，而A 组与B 组的肠和幽门盲囊中胰蛋白酶活性显著高于C 组（P ＜0.05）（图2）。

3 个密度组的刀鲚胰蛋白酶活性在4 种组织中分布存在差异（图2）。A、B 组肠中胰蛋白酶活性最高，分别为5 353.77 和4 187.11 U·mg-1，C 组肠中胰蛋白酶活性（818.84 U·mg-1）较A、B 组分别降低84.7%和80.4%。根据显著性检验结果可知，A组：肠＞幽门盲囊≈胃≈肝胰脏；B 组：肠＞幽门盲囊＞胃≈肝胰脏；C 组：幽门盲囊≈肠＞肝胰脏≈胃。

2.4 淀粉酶

3 种养殖密度对刀鲚肝胰脏、胃和幽门盲囊中淀粉酶活性影响不显著，而A 组（1.32 U·mg-1）和B 组（1.43 U·mg-1）肠中淀粉酶活性显著高于C 组（0.62 U·mg-1）（P＜0.05）（图3）。

A、B 组刀鲚肠中淀粉酶活性最高，其次为幽门盲囊（0.79 和1.01 U·mg-1）；C 组幽门盲囊中淀粉酶活性最高（1.09 U·mg-1）（图3）。根据显著性检验结果可知，A 组：肠＞幽门盲囊≈肝胰脏≈胃；B组：肠＞幽门盲囊＞肝胰脏≈胃；C 组：幽门盲囊＞肠＞肝胰脏≈胃。

图3 不同养殖密度下二龄刀鲚各组织淀粉酶活性Figure 3 Amylase activity in different tissues of 2-year-old Coilia nasus cultured at different densities

图4 不同养殖密度下二龄刀鲚各组织脂肪酶活性Figure 4 Lipase activity in different tissues of 2-year-old Coilia nasus cultured at different densities

2.5 脂肪酶

3 种养殖密度对刀鲚肝胰脏和胃中脂肪酶活性影响不显著，而A 组肠中脂肪酶活性（11.10 U·g-1）显著高于C 组（2.47 U·g-1）（P ＜0.05），C 组幽门盲囊中脂肪酶活性（4.87 U·g-1）显著高于B 组（1.05 U·g-1）（P ＜0.05）（图4）。

3 种养殖密度下均以肝胰脏中脂肪酶活性最高，分别为A 组：11.95 U·g-1、B 组：11.71 U·g-1、C 组：12.77 U·g-1（图4）。根据显著性检验结果可知，A 组肝胰脏、肠、胃和幽门盲囊中脂肪酶活性差异不显著；B 组：肝胰脏＞肠≈胃≈幽门盲囊；C组：肝胰脏＞幽门盲囊≈胃≈肠。

3 讨论

3.1 二龄刀鲚消化酶分布特点

鱼类的蛋白酶有碱性蛋白酶和酸性蛋白酶2 种，且在消化道不同部位的活性不同。胃蛋白酶是一种酸性蛋白酶，是有胃鱼类胃中作用最强的消化酶[14]，大量研究表明，胃蛋白酶在胃中的活性最高[4-5,14-18]，这与本试验二龄刀鲚的研究结果相同。Einarsson等[19]用免疫定位技术研究大西洋鲑（Salmo salarL.）的酶分泌细胞时发现，在胃里有大量分泌胃蛋白酶的腺细胞。根据本试验的结果，二龄刀鲚的胃极有可能是胃蛋白酶分泌的主要器官，但这一结果仍需结合免疫定位技术对二龄刀鲚胃中酶分泌细胞进行研究来确定。胰蛋白酶是一种碱性蛋白酶，在黑鲈（Micropterussp.）、丁鱥（Phoxinus tinca）和鲤（Cyprinus carpio）研究发现，胰脏主要分泌蛋白酶原，肝胰脏中蛋白酶活性很微弱，进入肠道在肠激酶作用下，不仅激活蛋白酶原，同时肠液还可增强蛋白酶的作用[20]；因此，主要依靠胰脏或肝胰脏分泌蛋白酶原的鱼类，由于测定前对肠道进行了清洗，其肠道中蛋白酶活性较低，如菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）[21]，但在对翘嘴鲌[2]、条石鲷（Oplegnathus fasciatus）[17]、施氏鲟（Acipenser schrencki）[22]、长鳍篮子鱼[3]、卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）[16]、西伯利亚鲟[4]等的研究表明，肝胰脏中蛋白酶活性较低，而肠道蛋白酶活性较强，或许说明肠道也具有分泌蛋白酶或者蛋白酶原的功能。通过对大西洋鲑的研究发现，其胰腺和肠道中均由大量分泌胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原的腺细胞[19]，因此，部分鱼类的肠道亦具有分泌胰蛋白酶原的功能，本试验不同密度组二龄刀鲚肝胰脏和胃中的胰蛋白酶活性较低，而A、B 组肠胰蛋白酶活性显著高于其余各组织（P＜0.05），幽门盲囊次之，C 组肠和幽门盲囊胰蛋白酶活性差异不显著（P＞0.05），但显著高于肝胰脏和胃（P＜0.05）。邓平平等[6]对长江刀鲚幼鱼的研究亦表明，肠道中胰蛋白酶活性最高，幽门盲囊次之。说明刀鲚肠是胰蛋白酶分泌的重要器官，幽门盲囊作为鱼类特有的消化器官，实质上是肠道的分支[1]，在蛋白消化过程中发挥重要的辅助作用，肝胰脏在胰蛋白酶原分泌中发挥的作用尚需进一步的研究。

有研究表明，胰脏或肝胰脏为淀粉酶生成的主要器官[23]，如大黄鱼[5]、鲇（Silurus asotus）[24]、黑鲷（Sparus macrocephlus）[25]、银鲳（Pampus argenteus）[15]等的肝胰脏中淀粉酶活性最高。而周景祥等[26]研究表明，大眼鰤鲈（Stizostedion vitreum）幽门盲囊是淀粉酶分泌重要器官；对西伯利亚鲟[4]的研究也发现，幽门盲囊中淀粉酶活性最高。在对其他一些鱼类的研究发现[3,16-17]，肠中淀粉酶活性最高。上述研究表明，不同鱼类淀粉酶分泌器官存在差异或同种鱼类各组织器官分泌淀粉酶能力不同。本试验研究表明刀鲚肠是淀粉酶分泌的重要器官，幽门盲囊在淀粉消化中发挥重要辅助作用，养殖条件的改变会影响刀鲚各组织淀粉酶分泌功能。肝胰脏是鱼类重要的消化腺，多数鱼类肝胰脏分泌的是淀粉酶原，其活性很低，进入肠道被激活发挥作用[27-28]，因此，尽管二龄刀鲚肝胰脏中淀粉酶活性较低，并不能说明肝胰脏不是淀粉酶的主要分泌器官，这仍需进一步的研究。

本试验表明，不同密度组肝胰脏脂肪酶活性最高，且B、C 组存在显著性差异，这与Das 等[20]认为肝胰腺为脂肪酶生成的主要器官的观点相符。肝胰腺分泌的酶液进入肠道发挥作用，肠是脂肪消化的主要场所[2,17]。二龄刀鲚脂肪酶存在于消化系统各个部分，或许说明消化系统各组织均具有一定的脂肪酶分泌能力。研究指出，脂肪酶活性与摄食饵料脂肪含量呈正相关[2,15]，本试验的低密度组饵料丰富，刀鲚摄食较多的生物饵料进入肠，诱发肠产生活性较高的脂肪酶，因此A 组肠的脂肪酶活性高于其余两组，并与C 组存在显著差异。

3.2 二龄刀鲚消化系统特点

鱼体消化酶组成与其食性密切相关，一般肉食性鱼类消化道短，蛋白酶活性强，草食性鱼类消化道长，淀粉酶活性强[4-5]。刀鲚为肉食性鱼类，其幼鱼的比肠长为0.241[29]，二龄刀鲚的比肠长为0.29～0.30，远低于其他一些肉食性鱼类，如大黄鱼（0.854）[5]、西伯利亚鲟（0.411）[4]、褐鲳鲉（Sebastiscus marmoratus）（0.54）[30]、军曹鱼（Rachycentron canadum）（0.43）[31]、波纹唇鱼（Cheilinus undulatus）（0.43）[32]、兰州鲇（Silurus lanzhouensis）（0.912）[33]等，而刀鲚肠道具有各主要消化酶，尤以胰蛋白酶和淀粉酶活性最高，弥补了肠道短的劣势，而幽门盲囊也在饵料的消化过程中发挥重要作用。除此之外，刀鲚胃中具有各主要消化酶，且胃蛋白酶活性显著高于其余各组织。有学者指出[34]胃发达的肉食性鱼类，蛋白质消化主要集中在胃，胃中蛋白酶活性显著高于其他组织。本试验中胃蛋白酶和胰蛋白酶定义不同，因此不能根据数值高低断定孰强孰弱，但可以肯定刀鲚胃在饵料的最初消化中发挥重要作用，尤以蛋白质消化最为明显，这也降低了肠道消化负担。因此，今后刀鲚饲料开发过程中，除了考虑饲料的适口性外，还需重视饲料的易消化性。

3.3 养殖密度对二龄刀鲚消化酶活性的影响

消化酶活性高低反映了鱼体对营养物质的消化吸收能力，受到多种因素影响：（1）个体发育[21,35-36]；（2）饲料营养成分[37-38]；（3）环境因子（温度[24-25,39]、pH[25,39]、溶氧[40-41]、盐度[6,42-43]、养殖密度[44-45]等）；（4）养殖模式[46-47]等。养殖密度是鱼类养殖中重要的环境因子，与养殖鱼类的生长、摄食及机体生理状况关系密切[48-49]。一些研究表明，鱼类在高密度养殖条件下其消化酶活性升高，如银鲳幼鱼高密度组的蛋白酶和淀粉酶活性显著高于低密度组[44]；鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）高密度组淀粉酶活性显著高于低密度组[50]；大菱鲆（Scophthalmus maximus）高密度组的蛋白酶和淀粉酶活性显著高于中、低密度组[45]；这主要是因为鱼类在高密度养殖环境下，受到空间拥挤胁迫，为了获取更多食物和协调种间关系需要消耗更多的能量，导致耗能活动增多、代谢水平提高[45,51]，据此解释，可知养殖密度过高导致养殖品种对有利生存空间和营养争夺趋于激烈，进而产生一系列应激行为。本试验二龄刀鲚养殖密度为500～1 500 尾·亩-1（约0.75～2.25尾·m-2，0.50～1.50 尾·m-3，2.21～6.64 g·m-3），远低于上述银鲳（初始体质量5.33 g，5～25 尾·m-3）[44]、鲢鱼（21.2～42.4 g·m-3）[50]和大菱鲆（初始体质量186 g，50～103 尾·m-2）[45]，这主要是因为刀鲚养殖主要依赖活体生物饵料[10,12-13,52-53]，适口生物饵料来源不稳定，无法维持全年不间断足量供应，因此限制了刀鲚养殖密度提高，可见二龄刀鲚养殖空间相对宽裕，养殖密度对刀鲚影响主要体现在对适口活体生物饵料的争夺。

饵料营养会影响消化酶的活性，王建等[38]的研究表明，肝脏和肠道蛋白酶活性随饲料蛋白水平（20%～35%）升高而提高；付辉云等[54]研究发现，彭泽鲫（Carassius auratus var. Pengze）肠道脂肪酶和胰蛋白酶活性随着饲料脂肪含量（5%～8%）的增加而逐步升高；孙学亮等[55]研究表明，淡水石斑鱼（Cichlasoma managuense）肠道淀粉酶活性随着饲料玉米淀粉含量（0%～11%）增加而逐步升高。由上可知，鱼类消化系统会根据摄入营养情况改变消化酶分泌策略，提高机体的消化吸收能力。本试验，低密度组二龄刀鲚各消化酶在其重要分泌器官中的活性均要高于或显著高于高密度组，如A 组（500 尾·亩-1胃中胃蛋白酶活性显著高于B 组（1 000 尾·亩-1）和C 组（1 500 尾·亩-1），A 组和B 组肠中胰蛋白酶和淀粉酶活性显著高于C 组，A组肠中脂肪酶活性显著高于C 组（P＜0.05），这主要是因为低密度条件下，饵料生物丰富，刀鲚摄食量增加诱导体内相应消化酶分泌和活性提高，加快了饵料的消化吸收效率。尤其值得注意的是高密度组（1 500 尾·亩-1）肠中胰蛋白酶活性急剧降低，这可能是因为试验投喂的日本沼虾蛋白含量较高（61.71%～64.68%）[56]，低密度组摄食较多，诱导肠中胰蛋白酶活性提高，而高密度组摄食较少，说明二龄刀鲚放养密度为1 500 尾·亩-1，添加小型日本沼虾20 kg 无法满足其摄食需求。因此，为了保证高密度组二龄刀鲚的生长，需在试验基础上进一步增加适口生物饵料的投放，肠中胰蛋白酶活性对饵料摄入量较为敏感，可作为验证养殖系统活体饵料生物是否满足刀鲚摄食需求的重要指标，此结果仍需进一步的试验验证。