固相萃取-色谱/质谱技术在油菜素内酯分析中的研究进展

林舒婷，张慧玲，童 萍, 2，卢巧梅, 2

(1.福州大学 环境与资源学院，福建 福州 350116；2.福州大学测试中心，福建 福州 350116)

油菜素内酯类(brassinosteroids，BRs)于1970年首次从油菜花中发现，是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸及乙烯后的第六大类内源性植物激素[1].这类激素不仅对植物种子萌发、细胞分裂分化、根系生长及共生等生理过程具有显著调控作用，还能增强植物在不利环境(高温、寒冷、干旱等)中的耐受性[2-4].

BRs在植物中含量甚少，植物组织中存在大量干扰物质.同时，该类激素结构中缺少光敏及易电离基团，均给BRs的超痕量分析带来困难.关于BRs样品预处理和检测方法较新的综述不多[5-7].2017年，Kanwar等[5]重点综述了BRs结构特点和分析方法(包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱、色谱/质谱技术等)，但关于BRs的样品预处理讨论的很少.固相萃取技术及一系列类似方法(固相微萃取、分散固相萃取、磁性固相萃取等)在BRs前处理中应用广泛.另一方面，色谱-串联质谱技术结合衍生化方法显著提高了BRs测定的准确性和灵敏度，并实现了更少量植物样品(毫克甚至亚毫克级)分析.本文围绕固相萃取有关方法和各种性能优良的新型吸附材料、衍生试剂展开讨论，分析近10年色谱-质谱方法高灵敏度检测BRs的最新进展.

1 油菜素内酯类植物激素概述

迄今为止，科学工作者已成功鉴定出81种天然BRs，并合成了100多种BRs类似物.BRs是由5α-胆甾烷骨架衍生而来，具有A、B、C、D四环母核和侧链[8-9](图1).天然BRs分为C27、C28及C29-BR三种类型，以C28类研究最多.其中，C28类的油菜素内酯(BL)活性最强.

图1 油菜素内酯类激素的化学结构Fig.1 Chemical structure of brassinosteroids

BRs普遍存在于植物的不同器官中[10]，含量以种子和花粉中居多、果实中最少.鉴于BRs在植物体内的作用非常重要，但内源含量很少，加上提取困难，故化学方法合成BRs及其类似物就显得很有必要，且在农业上已有不少成功应用.Zhou等[11]发现外源施用少量BRs，能参与农作物农药代谢过程、减少农药残留，显著提高作物的品质和产量.Zheng等[12]发现，经BRs处理过的植株，其矿质元素含量、光合作用指数、碳水化合物水平等明显升高.BRs与其它类植物激素存在交叉效应，共同调控植物的生长发育.例如，经外源BRs处理，能影响生长素、赤霉素、脱落酸等内源激素的生物合成和信号表达[13-14].

2 油菜素内酯类植物激素的固相萃取分析

BRs在植物体内浓度低，分析前需要进行样品预处理.BRs最常用的样品前处理方法是固相萃取(solid-phase extraction, SPE).基于SPE类似原理，又衍生发展了一些新技术，各种方法的特点及适用范围如表1所列.

表1 固相萃取及其相关方法的特点Table 1 Characteristics of solid phase extraction and related methods

2.1 固相萃取(SPE)

考虑到BRs的特性(含量低、中性化合物)，近几年针对SPE法测定BRs的研究更多集中于新型吸附材料、各种小柱串联组合使用上，以便提高预处理的回收率和选择性.

Ding等[15]改良了QuEChERS(快速、简单、廉价、有效、坚固和安全)方法，基于石墨炭黑和伯仲胺二氧化硅(GCB/PSA)双层SPE柱来萃取纯化植物内源性BRs.利用GCB去除疏水性化合物、PSA消除极性化合物干扰，结合高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)定量，BRs的回收率为71.1%～113.1%.2020年，Xin等[16]开发了串联混合模式强阳离子交换-弱阴离子交换(MCX-WAX)SPE前处理技术，高通量分析包括BRs在内的10类植物激素，方法基质效应介于61.8%～102.5%之间，其中BL和油菜素甾酮(CS)的回收率为83.7%～94.5%.

2.2 移液器尖端固相萃取法(PT-SPE)

为克服传统柱式SPE吸附剂、样品和溶剂消耗大、装填柱子容易堵塞等问题，Yu等[17]开发了移液器尖端固相萃取法(PT-SPE).该法通过阳离子交换和疏水作用，使用4-苯基氨基甲基-苯硼酸(4-PAMBA)对尖端混合型吸附剂进行改性，基于硼酸酯亲和作用选择性纯化植物提取物中的BRs.全过程在200 μL萃取头中1 h内完成富集，能显著减少吸附剂和植物样品用量.Deng等[18]选择季铵盐衍生试剂(BTBA)与BRs反应，结合移液枪头式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(SPT-SPE-UPLC-MS/MS)检测平台，最佳条件下，BTBA-BRs衍生物富集倍数高达1 190～448 785，最小检测量达到2.7～9.4×10-17mol/L.在仅0.5 mg水稻叶片中检出24-表油菜素内酯(24-epiBL)，首次实现亚毫克级植物样品中BRs定量，同时也是目前标记试剂中最灵敏的方法之一.

2.3 固相微萃取(SPME)

SPME于1990年首次提出[19]，能改善SPE回收率低、有机溶剂需求较大的不足.Wu等[20]建立了一种在线二维固相微萃取-柱衍生-高效液相色谱-串联质谱定量植物组织中BRs的方法.二维液相色谱柱依次填充苯基硼酸硅和C18吸附剂，整个测定时间小于30 min.以间氨基苯硼酸(m-APBA)为衍生剂，5种BRs的检测限在1.4～6.6 pg之间，灵敏度提高了13～8 437倍，回收率为79.8%～124.0%.Pan等[21]开发了一种实时衍生和富集的管内固相微萃取(in-tube SPME-DE-FSS-UPLC)法，用于分析复杂植物样品中超痕量的24-epiBL.分离分析在55 min内完成，检测限为0.7 pg/mL.

聚合物整体柱固相微萃取(PMME)具有传质阻力小、表面可功能化修饰、能实现原位萃取等特点.Ding等[22]使用双层固相萃取结合硼酸酯亲和聚合物整体微萃取(DL/SPE-BA/PMME)，成功去除大部分样品基质，实现了植物中BRs分析.Wang等[23]制备了聚(甲基丙烯酸-乙烯二甲基丙烯酸酯)(MAA-co-EDMA)，基于整体柱与衍生化BRs的离子交换作用,对拟南芥中28-表高油菜素内酯(28-epihomoBL)的检测限仅为2.0 pg/mL.2020年，该课题组将聚合物整体微萃取、原位衍生与液相色谱-质谱(PMME-ISD-LC-MS)联用，使用聚(3-磺丙基丙烯酸钾盐-亚甲基双丙烯酰胺)(SPA-co-MBA)整体柱作为捕集柱，通过离子交换作用将2-甲基-4-苯基氨基甲基苯基硼酸(2-methy-4-PAMBA)在线固定，BRs的选择性捕获和衍生同时进行.该方法成功用于1.0 mg植物样品中内源BRs的自动检测[24].

2.4 基质固相分散(MSPD)

与常规小柱式SPE、PT-SPE、SPME相比，基质固相分散法(MSPD)可同时进行样品的分离和均质，极大增加了吸附剂与目标物接触面积，具有样品消耗少、萃取快速等优点[25].Wang等[26]提出基质固相分散-混合模式强阴离子交换-混合模式强阳离子交换(MSPD-MAX-MCX)方法，能消除非极性、极性和电离性物质干扰，具有更低的基质效应.方法检测限为0.008～0.040 ng/mL，并应用于水稻开花期和成熟期内源BRs分析.

但由于从研钵向SPE小柱转移样品的过程中会损失部分样品，导致后续测量的灵敏度和准确度降低，因此该课题组延伸了另一种新型萃取方法-分散基质固相萃取(DMSPE)[27].将植物样品和分散剂在微量离心管中混合研磨，然后在离心条件下萃取和纯化.在优化条件下，5种BRs检出限为1.38～6.75 pg/mL，基质效应在82.4%～114.1%范围.这表明DMSPE方法能有效消除干扰，提高分析灵敏度，在极少量植物样品(油菜2.0 mg、拟南芥0.5 mg)中测得BRs.

2.5 磁性固相萃取(MSPE)

MSPE具有目标分析物易分离、操作简单等优点[28]，引入磁场分离提高了样品预处理效率，近年来在样品前处理领域应用非常活跃.2014年，Ding等[29]以二氧化钛包覆的磁性中空介孔二氧化硅球(TiO2/MHMSS)作为MSPE吸附剂和“微反应器”，10 min内即可完成对BRs的原位衍生，方法的灵敏度和分析速度都大为改善.之后，他们使用聚(4-乙烯苯基硼酸-聚乙二醇二甲基丙烯酸酯)[p(4-VPBA-co-EGDMA)]包覆的Fe3O4@SiO2作为顺序MSPE吸附剂，通过引入4-(N,N-二甲氨基)苯基硼酸(4-DMAPBA)溶液进行原位衍生化/解吸过程，提高了BRs的质谱信号，最终成功应用于多种植物不同器官中BRs类激素的定量，灵敏度可达pg/mL级别[30].2017年，基于不同化合物之间的性质差异，研究团队进一步采用顺序MSPE-UPLC-MS方法实现了6类植物激素的高通量分析[31].选择聚(N,N-二甲氨基苯基硼酸-聚乙二醇二甲基丙烯酸酯)磁性材料[Fe3O4@SiO2@p(DMAPBA-co-EGDMA)]富集5类植物激素(生长素、脱落酸、茉莉酸、赤霉素、细胞分裂素)，而Fe3O4@TiO2@BR(硼酸酯亲和磁性纳米粒子)萃取BRs.该方法在100 mg FW(fresh weight)的甘蓝型油菜花中可检测到16种植物激素，3种BRs含量为3.25～10.43 ng/g FW.

此外，Xin等[32]开发了一种基于硼酸亲和磁性纳米粒子(BAMNP)的高性能样品预处理方法，回收率介于70.5%～98.2%，基质效应降低到85.2%～92.4%.此法大大提高BRs分析的灵敏度，植物样品用量减少至10 mg以下.方法在BRs样品前处理技术的应用如表2所列(以SPE及类似方法为主).

表2 应用于BRs分析的固相萃取有关技术Table 2 Solid phase extraction and related methods used in BRs analysis

3 油菜素内酯类植物激素的色谱-质谱分析方法

BRs作为第六类植物激素，其发现和活性分析都离不开生物方法.早期应用最多的是大豆第二节间生物测定法(BSIB)[33]，通过节间生长情况、细胞分裂速度来判定BRs含量.BSIB是一种半定量方法，已无法满足BRs准确、快速分析的要求.随着质谱技术的迅猛发展，串联质谱、高分辨质谱、同位素标记质谱等方法拥有很强的质量精度和定性能力，结合各种衍生化技术，大大改善了质谱方法的选择性和灵敏度.色谱-质谱技术被公认为BRs分析的一个强大工具[5, 34-35].

3.1 气相色谱-质谱法(GC-MS)

GC-MS分析中，电子轰击源能产生丰富的碎片峰，选择离子监测(SIM)模式能提高方法的灵敏度，通过样品谱图与标准谱库比对，可快速获得目标物的结构信息，因此在早期新型BRs及类似物的发现和结构鉴定中发挥了重要作用.然而，BRs类极性较强、挥发性较差，在GC-MS测定前需要衍生化处理.BRs衍生主要包括硼化和硅烷化两步骤，即先采用甲硼酸和吡啶进行硼化，再与N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA)进行硅烷化反应[36-40].

Bhardwaj等[37]基于MSTFA衍生化处理，采用GC-MS,从未成熟的山茶花种子中分离鉴定出5种BRs及其类似物(即6-脱氧-2，8-正十八烷酮、6-脱氧-2，8-正十八烷酮、3-脱氢-6-脱氧-2，8-十八烷酮、6-脱氧-2，8-去甲甾烷醇和6-脱氧-2，8-去甲甾烷酮)，并证实上述化合物均是BRs类C-6氧化途径的活性成分.Kanwar等[40]利用GC-MS技术分析芥菜等幼苗在镍金属胁迫下，外源喷洒24-表油菜素内酯，对植物各项生化指标的影响.结果表明，植物中蛋白质含量提高,抗氧化酶活性增加，减轻了胁迫环境对植物生长的不利影响.研究进一步表明BRs确实参与了植物应激系统的防御.

GC-MS对BRs进行定量分析时，两步衍生复杂耗时、植物样品需要量较大，同时该类研究大多集中于2010年前，之后应用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)技术更为普遍.

3.2 液相色谱-串联质谱法(LC-MS或LC-MS/MS)

作为GC-MS的补充方法，LC-MS对样品的要求更为灵活、应用更为广泛.同其他酸性和碱性植物激素相比，BRs为中性甾体，使用LC-MS直接检测时电离效率不高、灵敏度较差.例如，Tarkowská等[41]建立了UPLC-ESI-MS/MS方法同时分析甘蓝型油菜花中22种BRs，分离在9 min内完成，检测限为0.05～40.00 pg.

虽然LC-MS能直接分析BRs，但通过化学衍生法，引入易电离基团，可以提高电离效率和检测灵敏度，是BRs超痕量分析的一个研究热点.基于硼酸能与BRs邻二醇官能团共价偶联，含氮原子的硼酸化合物被广泛用于BRs衍生，可使质谱响应提高2～3个数量级[20, 26, 29].

武汉大学冯钰锜课题组在BRs高灵敏度检测方面做了不少有意义的工作.2016年，选择硼酸盐衍生试剂4-PAMBA修饰的MCX吸附剂制备硼酸酯亲和探针，开发了一种镉胁迫下水稻中BRs的定量方法，原位衍生、富集同步进行，灵敏度提高了2 000倍以上[17].基于相同衍生试剂和原理，结合盐诱导相变萃取(SPTE)技术，6种BRs高选择性萃取的灵敏度提高至15 000倍[42].为解决目前BRs研究中C27类较缺乏的问题，课题组合成2-methy-4-PAMBA试剂，增加了C27-BR衍生物的稳定性，对了解C27-BR的生理功能和生物合成途径具有重要意义[43].紧接着，基于一锅煮多功能衍生化技术，分别采用N,N-二乙基乙二胺(DEED)和2-methy-4-PAMBA用于带羧基植物激素和BRs衍生化，结合LC-MS/MS技术鉴定了31种目标植物激素[44]，只需毫克级植物鲜样，就可考察拟南芥单朵花中多种植物激素的时空分布.2020年，基于2-methy-4-PAMBA选择性衍生BRs，检测限为0.10～1.29 pg/mL，并应用于拟南芥等多种植物样品检测[24].选择罗丹明B-硼酸(RhB-BA)为衍生试剂，建立液相色谱-高电压-多反应监测-质谱(LC-HV-p-MRM-MS)法用于油菜花中BRs定量[45].该方法将预处理时间缩短至10 min内，同时减少了溶剂消耗.

与LC-MS/MS相比，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的优势在于UPLC的色谱柱内径更细、耐压更高、分离速度更快.Pan等[21]提出管内SPME-DE-FSS-UPLC法，将在线衍生、富集和分离分析总时间控制在55 min内.Huo等[46]将衍生试剂2-溴吡啶-5-硼酸(BPBA)和超高效液相色谱-电喷雾电离三重四极杆质谱(UPLC-ESI-QqQ-MS)相结合，实现了拟南芥中BRs的超灵敏分析(检测限为2.00～8.00 pg/mL).Xin等[47]采用串联SPE法和6-甲氧基-3-吡啶基硼酸(MPyBA)衍生试剂，合成硼酸盐亲和功能化磁性纳米颗粒(BA-MNPs)特异性识别24-epiBL和CS，定量限分别为1.12、1.45 pg，回收率高于70%.同年，选择另一种衍生剂3-(二甲氨基)-苯基硼酸(DMAPBA)将24-epiBL的检测限降低至15.8 fg[48].2016年，该团队选择UPLC-MS/MS结合多反应监测(MRM)和增强产物离子扫描(EPI)功能，从1 g水稻组织中检测出14种新型潜在的BRs及类似物[49].

Deng等[18]首次利用新型衍生试剂4-硼-N,N,N-三甲基碘化苯胺季铵盐(BTBA)，BRs衍生物的灵敏度提高1 190～448 785倍，该PT-SPE-UPLC-MS/MS法最小检测量在13～42 fg范围内.Chen等[50]制备一种4-巯基苯基硼酸(4-MPBA)改性的螺旋弯曲介孔二氧化硅纳米纤维(mSiO2-SS-PBA)，结合在线萃取、衍生和UPLC-MS/MS技术，建立了一种快速简便的BRs高灵敏定量法.

除了将BRs衍生以提高其质谱检测灵敏度外，同位素内标法也能纠正BRs分析样品前处理过程的误差，提高其定量精确度.Yu等[51]建立了稳定同位素标记-液相色谱-多反应监测扫描质谱(SIL-LC-MRM-MS)法，利用同位素标记试剂4-PAMBA、4-PAMBA-d5与BRs中顺式二醇反应，先后研究了重金属镉胁迫下水稻中BRs含量变化[17]以及油菜花不同组织中潜在的13种BRs.次年，该作者利用改进的2-methy-4-PAMBA和2-methy-4-PAMBA-d5标记试剂，开发了一种能够鉴定包括C27-BR在内的10个油菜花中BRs的方法[43].LC-MS技术在BRs分析中的应用如表3所列.

表3 LC-MS在BRs分析中的应用Table 3 Application of liquid chromatography-mass spectrometry in BRs analysis

4 总结与展望

BRs对植物生长发育的作用毋庸置疑.和其他类植物激素相比，BRs浓度低、缺少光敏及易电离基团，其超微定量分析是所有植物激素检测中最具挑战的问题之一.因此，BRs的前处理技术(包括新材料和新方法)和高灵敏度检测方法将会成为今后研究的发展方向.衍生化技术在BRs分析中应用普遍，开发新型更高效的衍生试剂是提高灵敏度的一个很直接、有效的方法.同时，探索BRs在植物体内时空分布行为和生理作用机制，也具有重要研究意义.