亚麻酸纳米乳制备工艺

朱月霞，戚嘉怡，喻樊 ，缪怡烨

1.盐城师范学院药学院（盐城 224051）；2.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室（盐城 224002）；3.南京工业大学（南京 210000）

亚麻酸（linoleic acid，LA）是一种天然的疏水不饱和脂肪酸，有助于食品的风味和稠度，并使人在进食时感到饱足，对动物和人体无毒[1]。亚麻酸外观呈淡黄色液体，容易氧化[2]。另外，亚麻酸能降血脂、治疗肥胖症、预防非酒精性肝炎，还能对癌症有一定的治疗作用，包括减少癌细胞的生成、转移和减少肿瘤面积[3-6]。但动物体内不能合成亚麻酸，只能从外界获取。

近年来对亚麻酸的剂型的研究中，制备成胶囊[7-8]较多，也有制备成脂质体[9]。但将亚麻酸制备成纳米乳的报道很少。纳米乳是由水、油、乳化剂和助乳化剂组成的胶体分散体系，具有热力学稳定性好、液滴小等特点，粒径在10～200 nm之间，作为载体可以提高药物的生物利用度[10-11]。此次试验将亚麻酸制成纳米乳，对亚麻酸的应用具有重要的意义，为亚麻酸的剂型研究提供了参考。

1 材料

1.1 主要仪器与设备

台式电动离心机（常州国华电器有限公司）；UV-1800型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；B11-3型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；JEM-1400 plus透射电子显微镜（日本）。

1.2 主要材料与试剂

亚麻酸（许昌元化生物科技有限公司）；油酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大豆油（上海泰坦科技股份有限公司）；棕榈酸异丙酯（山东优索化工科技有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯（山东优索化工科技有限公司）；聚山梨酯80（Tween-80，国药集团化学试剂有限公司）；Span-80（上海展云化工有限公司）；OP-10（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；1, 2-丙二醇（上海展云化工有限公司）；聚乙二醇-400（国药集团化学试剂有限公司）；焦性没食子酸（邻苯三酚，上海展云化工有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，上海蓝季生物有限公司）；DPPH（上海蓝季生物有限公司）；营养琼脂培养基（杭州微生物试剂有限公司）；大肠杆菌（CMCC（B）44102）；金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003）；等。

2 试验方法

2.1 标准曲线的绘制

以无水乙醇为溶剂制备质量浓度为1 mg/mL的亚麻酸母液，在190～1 100 nm范围内用紫外分光光度计进行扫描。结果显示，亚麻酸的乙醇溶液在234 nm处出现最大吸收峰，故最大吸收波长选择234 nm。稀释亚麻酸母液制备梯度浓度0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mg/mL，横坐标为亚麻酸溶液的质量浓度，纵坐标为吸光度，对其进行线性回归，得亚麻酸标准曲线方程。

2.2 亚麻酸纳米乳的制备

2.2.1 亚麻酸纳米乳辅料的筛选[12]

选择大豆油、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸为备选油相，Tween-80、Span-80、OP-10为备选乳化剂，1, 2-丙二醇、聚乙二醇-400为备选助乳化剂。取适量的亚麻酸置离心管，加适量油相、乳化剂和助乳化剂，观察二者是否相融以及融合后的现象，并且测定各混合组分的吸光度，通过计算亚麻酸在各种溶剂中的溶解度来筛选最适的辅料。

2.2.2 伪三元相图筛选亚麻酸纳米乳处方[13]

将油相与乳化剂和助乳化剂组成的混合乳化剂（Km=1∶1，2∶1和3∶1）按照质量比1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1的比例混合，在磁力搅拌器上恒温恒速搅拌，缓缓滴加纯化水，观察体系溶液由浑浊变澄清或由澄清变浑浊的现象，记录临界点，计算各组分百分比。用Origin Pro 8.0软件绘制伪三元相图。

2.2.3 亚麻酸纳米乳的制备

称取处方量的亚麻酸、油相、乳化剂、助乳化剂，缓缓滴加纯化水，在磁力搅拌器上充分搅拌混匀，可制得略带淡蓝色乳光且外观澄清的亚麻酸纳米乳。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 羟自由基清除率

采用水杨酸法[14]测定亚麻酸的羟基自由基清除活性。在还原性过渡金属Fe2+和H2O2存在的情况下，Fenton反应可以形成羟基自由基，H2O2是所有还原性二氧化合物中反应最活跃的，被认为会引发细胞损伤[15]。Fenton反应为H2O2+Fe2+＝OH-+H2O+Fe3+，且生成物在510 nm处有特征吸收。

制备质量浓度为5 mg/mL的样品溶液。各溶液的加入量如表1所示，依次加入9 mmol/L的FeSO4、9 mmol/L的乙醇-水杨酸、8.8 mmol/L的H2O2后摇匀，于37 ℃水浴加热15 min后取出，以不加双氧水的体系为参比溶液，摇匀测定吸光度。

表1 羟自由基清除试验 单位：mL

式中：A0为空白对照的吸光度；Ax为加样品的吸光度；Ax0为不加显色剂H2O2的吸光度。

2.3.2 超氧自由基清除率

采取邻苯三酚自氧化法[16]测定亚麻酸的超氧自由基的活性。

在比色皿中依次加入0.1 mol/L Tris-HCl，3 mmol/L的邻苯三酚和样品溶液后摇匀测定样品，即Ai，设置测定波长325 nm，并每隔30 s读数1次，至300 s为止，参比溶液为0.1 mol/L Tris-HCl溶液。同时空白以10 mmol/L的HCl溶液代替邻苯三酚同上进行测定，即A0。清除率按式（2）计算。

2.3.3 DPPH自由基清除率

DPPH法是一种准确、简便的试验，用于测定样品的抗氧化能力。深紫色的稳定DPPH自由基溶液在517 nm处显示出强吸收带。在抗氧化剂存在下，由于抗氧化分子1, 1-二苯基-2-苦基肼（黄色）的DPPH自由基（紫色）减少，吸光度降低[17]。

各溶液的加入量如表2所示。分别移取不同体积的样品溶液，超纯水补足至1 mL，再加1 mL的DPPH溶液，充分摇匀后避光反应30 min，参比溶液为超纯水，在517 nm波长下测定吸光度，即Aj。另外1 mL样品溶液加1 mL的无水乙醇作为空白对照测定吸光度，即Ai。同时1 mL的超纯水加1 mL的DPPH溶液测定吸光度，即A0。清除率按式（3）计算。

表2 DPPH自由基清除试验 单位：μL

2.4 纳米乳的表征

2.4.1 包封率

包封率是衡量纳米乳液质量的一个重要指标，采用微柱离心法[18]对亚麻酸纳米乳的包封率进行检测。SephadexG-75葡聚糖凝胶在去离子水中浸泡过夜，充分溶胀。取2.5 mL注射器去掉内芯，取一点棉花垫入注射器内，然后剪下合适大小的滤纸垫入其中，将浸泡好的SephadexG-75少量多次加入，静置一段时间后放入离心机中，以100 r/min离心1 min，得到高度约1 cm的独立凝胶柱。取100 μL空白纳米乳，加入微型凝胶柱的顶端，静置预饱和20～30 min。取30 μL制备好的亚麻酸纳米乳，加于微型凝胶柱的顶端，加2 mL纯化水，并用100 r/min离心1 min，收集洗脱液，连续操作，每次收集的洗脱液加入容量瓶中，用无水乙醇定容。测定吸光度，直至吸光度接近0说明洗脱完成，并以管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线选择需要洗脱的管数，并将这几管的洗脱液合并，用无水乙醇定容至10 mL。同时，取30 μL亚麻酸纳米乳，用无水乙醇定容至10 mL。用紫外分光光度计在234 nm处分别测定亚麻酸洗脱前和洗脱后的吸光度，根据式（4）计算包封率。

式中：C柱后为微柱离心后纳米乳中的药物的质量浓度；C柱前为微柱离心前纳米乳中的药物的总质量浓度。

2.4.2 形态观察[19]

取适量制得的亚麻酸纳米乳，蒸馏水稀释100倍，滴在铜网上，静置一段时间，用滤纸吸干，滴加2%磷钨酸溶液负染5～10 min，自然挥发干，通过透射电子显微镜观察纳米乳形态。

2.5 抑菌活性[20]

取培养好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液，至超净台操作。每支试管中加900 μL的生理盐水，再用移液枪取100 μL培养好的大肠杆菌菌液加至第一支试管混匀，记为10-1CFU/mL。再取100 μL第一支试管中菌液至第二支试管，以此类推，将菌液稀释至10-7CFU/mL。金黄色葡萄球菌的稀释操作同上。

制备质量浓度为0.50，0.25和0.125 mg/mL的亚麻酸纳米乳溶液，同时阴性对照空白纳米乳也稀释相应的质量浓度，配制质量浓度为5 mg/mL的阳性对照青霉素标准液。灭菌后营养琼脂培养基后倒平板，加5 μL上述稀释好的菌液涂布后放至水平位置待用，在培养皿中等间距放3～4个牛津杯（内径6 mm，外径7.8 mm，高10 mm），并加入200 μL上述不同质量浓度的溶液，放入37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h，然后测量抑菌圈直径。

3 结果与分析

3.1 标准曲线

亚麻酸的乙醇溶液在234 nm处出现最大吸收峰，故最大吸收波长选择234 nm。以亚麻酸溶液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，亚麻酸标准曲线方程为y=1.006 1x+0.109 7（r2=0.994 1），表明亚麻酸在质量浓度为0.1～0.8 mg/mL内线性关系良好。

3.2 亚麻酸纳米乳的制备

3.2.1 亚麻酸在各辅料中的溶解度

从表3可以看出，在4种油相中，亚麻酸在油酸中的溶解度最大；在3种乳化剂中，亚麻酸在Tween-80中的溶解度较好；在2种助乳化剂中，亚麻酸在1, 2-丙二醇中的溶解度较高。因此，以油酸为油相，Tween-80为助乳化剂，1, 2-丙二醇为助乳化剂做进一步研究。

表3 各种不同溶剂中亚麻酸的溶解度

3.2.2 伪三元相图

绘出伪三元相图后，用image J软件比较不同Km值的相图面积。由图1和表4可知，当油酸-Tween-80-1, 2-丙二醇-水的处方在Km=2∶1时面积最大，根据纳米乳外观，选择1∶9比例的油相与混合乳化剂。

表4 不同Km值的伪三元相图面积

图1 不同Km值下空白纳米乳的伪三元相图

3.2.3 制备亚麻酸纳米乳

确定亚麻酸纳米乳的最佳配方：亚麻酸2.26%、油酸2.26%、Tween-80 13.53%、1, 2-丙二醇6.76%、纯化水75.19%。称取亚麻酸、油相、乳化剂、助乳化剂，缓慢纯化水，在磁力搅拌器充分搅拌混匀不断搅拌，制备的亚麻酸纳米乳略带淡蓝色乳光且外观澄清。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 羟自由基清除率

载药纳米乳的组成为亚麻酸、油酸、Tween-80、1, 2-丙二醇，测得A0为0.863（见表5）。

表5 载药纳米乳的羟自由基清除率

结果表明含亚麻酸的载药纳米乳的羟自由基清除率大，同时含油酸的空白纳米乳也有一定的羟自由基清除作用（见表6）。

表6 空白纳米乳的羟自由基清除率

3.3.2 超氧自由基清除率

采用的样品质量浓度为0.15 mg/mL，计算得载药纳米乳的超氧自由基清除率为23.08%，空白纳米乳的超氧自由基清除率为17.58%。考虑到油酸的影响，所以对同时不含油酸和亚麻酸的组分也进行了测定，不含油相组分的超氧自由基清除率为12.09%。结果发现相比较空白纳米乳，含亚麻酸的载药纳米乳的超氧自由基清除率较大，有一定的超氧自由基清除作用。相比较不含油相的纳米乳，空白纳米乳的清除率较高，则表明油酸也有一定的超氧自由基清除率。

3.3.3 DPPH自由基清除率

样品质量浓度为5 mg/mL的载药纳米乳和空白纳米乳，由表7可以发现，空白纳米乳的DPPH自由基清除率很小，是由于样品质量浓度的影响。但是从数据中可以发现载药纳米乳的DPPH自由基清除率比空白纳米乳的大，说明亚麻酸有一定的DPPH自由基清除能力。

表7 DPPH自由基清除率测定结果

3.4 纳米乳的表征

3.4.1 包封率

根据图2的洗脱曲线，选择前4管的洗脱液合并测定吸光度。经紫外分光光度计测定，微柱离心后的吸光度为0.297，微柱离心前的吸光度为0.390。根据标准曲线计算得C柱后为0.186 mg/mL，C柱前为0.279 mg/mL，包封率为66.7%。

图2 亚麻酸的洗脱曲线

3.4.2 形态观察

由图3可以看出，纳米乳微观形态呈球形，乳滴分布均匀无粘连，粒径约176 nm。

图3 亚麻酸纳米乳透射电镜微观形态

3.5 抑菌活性

由表8可知，空白纳米乳无抑菌性，亚麻酸纳米乳的抑菌效果低于青霉素标准液，3个浓度的亚麻酸纳米乳对两种菌均有较好的抑菌效果，在质量浓度0.5 mg/mL的抑菌效果最好。

表8 抑菌试验结果

4 讨论与结论

采用伪三元相图筛选亚麻酸纳米乳的最适处方，目测观察浑浊到澄清现象来判断相转变的临界点。试验发现，并不是所有的比例均能形成纳米乳，纳米乳是透明或透明略带乳光的液体状，而有些是形成乳白色不透明的液体状，后需加很大比例的水才会逐渐变成透明样，一些不易形成的点绘制伪三元相图时，选择由黏状的液晶态到液体状的临界点来绘图。

考察了亚麻酸的抗氧化活性，包括羟自由基、超氧自由基、DPPH自由基三个方面。清除羟自由基是一种重要的抗氧化活性，羟自由基具有很高的反应活性，使其能够与活细胞中广泛存在的分子（如糖、氨基酸、脂类和核苷酸）发生反应。超氧自由基对细胞成分非常有害，它容易与DNA和蛋白质发生反应，需要在生物系统中立即清除。DPPH存在一个稳定的自由基，常被用于测定天然化合物的自由基清除活性，在DPPH试验中研究了亚麻酸作为氢原子或电子供体将DPPH转化为缩合型DPPH-H的能力。试验发现，含油酸的组分与不含油相的组分相比较高，说明油酸有一定的自由基清除能力，而当组分中加入亚麻酸后清除率有很大的提高，说明亚麻酸自由基清除能力强。采用牛津杯法测定亚麻酸的抑菌活性，试验发现亚麻酸纳米乳有较好的抑菌效果。