RNF2在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞生物学行为的影响*

贾楠，宋哲，陈宝胜，程进生

（1.沧州市中心医院普外二科，河北沧州061001；2.献县人民医院，河北沧州062250）

结直肠癌已成为我国第3 大常见恶性肿瘤[1]。年龄＞50 岁、有结直肠癌家族史、相关消化系统病史及不健康的生活饮食习惯均是结直肠癌发生的高危因素。近年对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为研究较多，大量报道显示结直肠癌生物学行为可能影响患者抑癌基因、癌基因、血清肿瘤相关标志物及细胞因子，从而加重疾病发展[2-3]。研究表明[4]，环指蛋白2（cyclic finger protein 2,RNF2）具有E3 连接酶活性，对血管正常发育、生长、重塑及细胞增殖、迁移、侵袭有显著影响。另RNF2 还可负反馈影响血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF） 表达，对内皮细胞增殖及血管生成产生抑制作用。国内已有研究证实RNF2 在食管癌、乳腺癌等肿瘤中均呈异常表达，且与多种疾病发生、发展密切相关[5-6]。同时，也有多项研究对结直肠癌组织中相关因子表达进行报道，并指出其可能参与癌细胞生物学过程[7-8]。以上均提示RNF2 在癌细胞侵袭、迁移、血管生成等方面具有显著影响。但结直肠癌组织中RNF 的表达及其临床意义尚无相关报道，因此本研究就此展开讨论，以期为结直肠癌治疗提供新思路和方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年6月—2019年6月沧州市中心医院收治并确诊的62 例结直肠癌患者的癌组织及距癌旁＞2 cm 正常黏膜组织。其中，男性40例，女性22例；年龄40～79岁，中位年龄65岁，≥65岁38例，＜65岁24 例；发病部位左39 例，右23 例；乳头状腺癌8 例，管状腺癌40 例，其他腺癌14 例；高分化11 例，中分化35 例，低分化16 例；Dukes 分期A、B 期39 例，C、D 期23 例；无淋巴结转移38 例，有淋巴结转移24 例。纳入标准：①经病理学检查确诊为结直肠癌且均为腺癌；②入院前未接受放、化疗；③临床资料完整，相关检查完善；④入院前无重大出血史；⑤肝、肾、心功能均正常。排除标准：①预计生存期＜2 个月；②对治疗不耐受；③血标本采集困难或标本不正确；④过敏体质；⑤合并精神疾病或语言功能障碍。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，患者签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色

取结直肠癌组织及癌旁正常组织，10%甲醛溶液（上海远慕生物科技有限公司）固定，经梯度浓度酒精（上海谱振生物科技有限公司）脱水，二甲苯（北京三药科技开发公司） 透明；采用Arcadia 组织包埋机（浙江徕卡生物科技有限公司）将组织用石蜡（上海依赫生物科技有限公司）包埋成块，连续切成4 μm 厚切片，依次采用二甲苯、沸腾的柠檬酸钠缓冲液（长沙达尔锋生物科技有限公司）、3%过氧化氢（上海泽叶生物科技有限公司）进行脱蜡、抗原修复、梯度酒精水化、PBS 漂洗、内源性过氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人RNF2 多克隆抗体（Sino Biological，浓度1∶100）4℃孵育过夜，PBS 漂洗3 次后滴加通用型二抗（厦门研科生物技术有限公司）37℃孵育30 min；再次漂洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（武汉纯度生物科技有限公司），37℃孵育20 min；PBS漂洗，经DAB（上海恒斐生物科技有限公司）显色、苏木精（上海源叶生物科技有限公司）复染，脱水，透明，封片，Olympus CX31 光学显微镜（广州科适特科学仪器有限公司）下观察结直肠癌组织和癌旁正常组织中RNF2 表达。由5年以上临床经验的专科医师在不清楚患者资料情况下观察和判定结果：着色细胞染色强弱：0 分无色，1 分黄色，2 分棕黄色，3 分棕褐色；阳性细胞所占视野百分比：0 分为阳性细胞率≤5%，1 分为阳性细胞率＞5%～25%，2分为阳性细胞率＞25%～50%，3分为阳性细胞率＞50%。两项评分之积为最终得分：阴性0～1分，弱阳性2分，阳性3～4分，强阳性5～6分。最终得分≤2 分阴性表达；最终得分＞2 分阳性表达。

1.3 细胞增殖、迁移及侵袭实验

1.3.1 CCK-8 法依次准备结直肠癌细胞系HCT116（上海酶研生物科技有限公司），阴性对照组病毒原液（HCT116-control）与RNF2 过表达的病毒原液（HCT116-RNF2）作为3 个组，传代培养各组细胞，取生长状态良好的对数生长期细胞制备成单细胞悬液，接种于96 孔细胞培养板中（2×103个/孔）；待细胞贴壁后，每孔加入10 μl CCK-8 试剂（上海炎熙生物科技有限公司），37℃孵育0 h、12 h、14 h、36 h、48 h 后在HBS-1096A 酶标仪（美国Bio Tek公司）540 nm 处检测各孔光密度（OD）值。

1.3.2 Transwell 细胞迁移、侵袭实验细胞划痕实验：取转染后细胞使各组细胞密度约为90%，用200 μl 无菌枪头对孔板培养细胞进行划痕处理，PBS 缓冲液洗涤3 次，加入无血清培养基，于5%CO2、37℃的培养箱中培养24 h，Image J 软件计算每个视野的划痕面积，细胞迁移率=（T0时面积-T24时面积）/T0时面积*100%。Transwell：调整细胞浓度为5× 105个/ml，向上室加入细胞悬液200 μl，向下室加入700 μl 培养基（含有20% FBS），48 h后将Transwell 小室进行PBS 清洗，置于甲醛中固定15 min，0.2%结晶紫（北京百奥莱博科技有限公司）染色20 min，随机选取5 个视野拍照并进行技术统计；将Transwell 小室上表面铺适量厚度的基质胶，按上述步骤操作，显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用SNK-q检验；计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁正常组织中RNF2的表达

RNF2 主要定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒（见图1）；结直肠癌组织中RNF2 阳性表达率高于癌旁正常组织（P＜0.05）。见表1。

图1 免疫组织化学染色切片图 （SP×200）

表1 结直肠癌组织和癌旁正常组织RNF2阳性表达率比较 （n=62）

2.2 RNF2 表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

不同性别、部位的直肠癌患者的RNF2 表达阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同年龄、组织学类型、分化程度、Dukes 分期、淋巴结转移的结直肠癌患者的RNF2 表达阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 结直肠癌患者不同因素间RNF2表达阳性率的比较例（%）

2.3 过表达RNF2对HCT-116增殖的影响

各组过表达RNF2 后12 h、24 h、36 h、48 h 后HCT-116 细胞OD 值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD 值有差异（F=3 203.034，P=0.000）；②各组OD 值有差异（F=476.864，P=0.000）；③各组OD 值变化趋势有差异（F=4 247.089，P=0.000）。见表3。

表3 不同组别与不同时间的细胞OD值比较 （±s）

表3 不同组别与不同时间的细胞OD值比较 （±s）

组别0 h 12 h 24 h 36 h 48 h HCT116组HCT116-control组HCT116-RNF2组0.33±0.04 0.30±0.04 0.31±0.02 0.49±0.06 0.31±0.03 0.32±0.05 0.48±0.14 0.30±0.06 0.30±0.05 0.77±0.12 0.32±0.05 0.31±0.04 0.96±0.13 0.34±0.04 0.33±0.05

2.4 过表达RNF2对HCT-116迁移的影响

HCT116、HCT116-control、HCT116-RNF2 组HCT116 细胞划痕面积，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=35.400，P=0.000）；两两比较，HCT116-RNF2 组细胞划痕面积大于HCT116-control组、HCT116 组（P＜0.05）。见图2 和表4。

图2 细胞划痕实验

表4 各组HCT116细胞迁移率比较（n=10，个，±s）

表4 各组HCT116细胞迁移率比较（n=10，个，±s）

注：①与HCT116 组比较，P ＜0.05；②与HCT116-control 组比较，P ＜0.05。

细胞迁移率6.65±3.77 45.32±4.05 61.17±4.22①②组别HCT116组HCT116-control组HCT116-RNF2组

2.5 过表达RNF2对HCT116侵袭的影响

HCT116 组、HCT116-control 组、HCT116-RNF2组穿过小室膜的细胞数分别为（0.84±0.32）、（0.71±0.27）和（1.32±0.39），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=9.462，P=0.001）；两两比较，HCT116-RNF2 组穿过小室膜的细胞数多于HCT116-control组、HCT116组（P＜0.05）。见图3。

图3 过表达RNF2对HCT116侵袭的影响

3 讨论

近年对肿瘤细胞侵袭、转移等生物学行为的报道较多，在结直肠癌组织中癌细胞的侵袭可经病灶部位蔓延至淋巴管，快速扩散、增殖至全身[9]。既往多认为胚胎发育及干细胞自我更新与该病理特性有关[10]，而目前关于RNF2 与肿瘤间的关系报道较多，学者提出RNF2 与肿瘤相关标志物、血管纤维化及基因转录、逆转录过程密切相关[11-12]。

刘建敏等[13]早已指出RNF2 为肿瘤相关敏感因子，通过下调RNF2 表达，发现喉癌细胞生长受到显著抑制。该实验结果对本研究有一定参考价值，考虑可通过敲除或下调RNF2基因判断其对生物性特性的影响。本文探究结直肠癌组织RNF2 表达与其生物学特性的相关性，目前尚未见此类相关报道，具有一定创新性。本研究显示结直肠癌组织中RNF2 表达水平高于癌旁正常组织，且年龄≥65岁、高、中分化程度，Dulses 分期C、D 期、有淋巴结转移的结直肠癌患者RNF2 表达阳性率高，符合既往研究中指出的RNF2 在肿瘤组织中呈高表达特点。结直肠上皮正常细胞发生突变后，可通过刺激肽类血管生成因子表达而产生大量RNF2 蛋白抑制血管形成、重塑及机体正常组织器官功能维护。目前已发现的18 个多梳蛋白家族（PcGs）成员中RNF2 为其核心成员之一，与PcGs 一样可通过表观遗传学事件抑制靶基因活性而参与肿瘤发生与发展。RNF2 通过催化组蛋白赖氨酸单泛素化造成基因沉默和抑制转录过程，从而发挥促癌作用[14]。另GERGELY 等[15]上调大鼠RNF2 基因后其内皮细胞形态异常，血管稳定性遭到破坏，且癌细胞增殖和侵袭能力加强。YANG 等[16]的动物模型实验显示，食管癌鼠敲除RNF2基因后小鼠血管、血管腔变小，毛细血管减少，内皮细胞与成纤维细胞的联系异常。以上实验均说明RNF2 对血管生成、干细胞增殖分化和干细胞自我更新有抑制作用，且可促进癌细胞发生和发展。同时考虑RNF2过表达可导致细胞对细胞外基质的黏附减弱，从而提高肿瘤增殖、侵袭能力。为进一步探究RNF2过表达对结直肠癌细胞迁移、增殖、侵袭等生物学行为的影响，本研究利用过表达慢病毒转染HCT-116 细胞构建过表达RNF2 的HCT-116 细胞系并进行细胞增殖、迁移及侵袭实验，结果发现过表达RNF2 后，结直肠癌细胞体外迁移、增殖、侵袭能力明显提高。有研究认为RNF2 可能通过FBXW7基因位点促进结结直肠癌细胞生物学行为的发生[17]。

综上所述，过表达的RNF2 可影响结直肠癌细胞生物学行为，可为结直肠癌治疗提供新的治疗靶点。但由于本研究样本量少、随访时间短，关于RNF2 是否可能成为结直肠癌治疗靶点需在临床研究中进一步探讨。