破格救心汤加减对心力衰竭模型大鼠心肌能量代谢的干预作用及机制研究*

王月峰，张翠利，张天栋，赵小顺

(1.新乡市中心医院药学部，河南 新乡 453000； 2.黄河科技学院医学院，郑州 450063)

心力衰竭是指由于心脏的收缩功能或舒张功能障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，引发静脉系统血液瘀积，动脉系统血液灌注不足，最终导致心脏循环障碍的一种疾病，此病表现为肺瘀血、腔静脉瘀血[1]。研究认为，心力衰竭的发生与心肌细胞凋亡、心肌能量代谢相关，此病发生后心肌能量代谢显著降低，虽然已经有研究证实心力衰竭与心肌能量代谢相关，但其具体作用机制尚不完全明确，仅有研究显示[2-3]，心肌能量代谢与能量代谢底物的利用、氧化磷酸化所产生的能量以及能量ATP的转运、利用有关。临床常规西医治疗心力衰竭并不能完全治愈，部分患者预后复发率较高，目前逐渐将关注热点转移至中医药治疗此病上。中医学认为心力衰竭属于“惊悸”“心痹”等范畴，治疗此病应重视扶阳，以温阳利水为治疗原则[4]。基于上述背景，在本文中将破格救心汤加减应用于心力衰竭模型中，以分析对大鼠心肌能量代谢的影响及具体作用机制，明确破格救心汤加减治疗心力衰竭的作用机制，为破格救心汤临床加减在心力衰竭治疗中提供参考。本研究已通过我院实验动物伦理委员会审查，伦理委员会批号WYZLL[2019]1601。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF级SD健康大鼠30只，鼠龄(3.9±0.6)个月，体质量(225.8±11.5)g，雌雄各半，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，实验动物号SCXK(京)2019-0011，所有大鼠均于我院清洁级实验动物房适应性饲养1周，5只/笼，采用光照定时装备，提供昼夜光变化周期(12 h光照，12 h黑暗)，温度为20～23 ℃，相对湿度为40%～60%，以清洁木屑为垫料，使用标准饲料饲养，自由饮水进食。

1.2 主要试剂

小鼠抗大鼠SIRT1抗体(品牌：Abnova，货号MAB21871)艾美捷科技有限公司；兔抗大鼠PGC-1α抗体(上海恒斐生物科技有限公司，品牌：CST，货号PGC1α Antibody)，Na+-K+-ATP酶 ELISA试剂盒(上海圻明生物科技有限公司，品牌：KA&M-BIO，货号mEA-R31772)，Ca+-ATP酶 ELISA试剂盒(上海振誉生物科技有限公司，品牌：elabscience，货号E-EL-M0209 km)。

1.3 分组与建模

随机选取10只大鼠作为空白组，另外20只大鼠参照Ahemed LA等[5]研究方法，将阿霉素配制成2 mg/mL的溶液，连续6周注射于大鼠腹腔(4 mg/kg)建立慢性心力衰竭大鼠模型。造模结束后，使用10%水合氯醛麻醉大鼠，使大鼠仰卧在操作台上，固定并剃除胸前区毛发，测定左心室射血分数(LVEF)，左心射血分数<60%则表示心力衰竭大鼠模型建立成功。将建模成功的20只大鼠随机分为模型组、给药组各10只。

1.4 给药

破格救心汤加减组方：附子150 g，山萸净肉120 g，炙甘草、干姜各60 g，生龙牡粉、活磁石粉、高丽参(另煎)各30 g，黄芪20 g，丹参15 g，枳壳9 g，麝香(冲)0.5 g。上述药物组成破格救心汤加减组方，加水2000 ml使用文火煎煮，取400 ml。造模成功后给药组大鼠使用10 mL/kg破格救心汤加减灌胃，空白组和模型组使用等剂量生理盐水灌胃，每天2次，连续治疗6周。

1.5 切片及染色

随机选取各组中1只大鼠断头立即取出心肌组织，40 mL/L的多聚甲醛固定，常温下使用15%的EDTA脱钙，脱水后行石蜡包埋，制作3 μm的组织切片，行HE染色处理，使用光学显微镜观察大鼠心肌组织病理表现。

1.6 心功能检测

随机选取各组中4只大鼠10%水合氯醛麻醉，剃除局部毛发，使用高分辨率小动物超声系统测定3组大鼠左心室舒张内径(LVEDD)、收缩末内径(LVESD)、LVEF以及左心室短轴缩短率(FS)，测量连续完整的4个心动周期，取平均值并同时记录大鼠心率(HR)。

1.7 血流动力学检测

在大鼠完成心功能检测后，分离大鼠右侧颈动脉，插入连接高精度压力换能器的PE-50型聚乙烯心导管至大鼠左心室，对3组大鼠左心室收缩末压(LVESP)、舒张末压(LVEDP)以及左心室内压上升、下降速率(±dp/dt)进行检测。检测完成后将3mL10%氯化钾液注射于大鼠静脉中，促使大鼠心脏在舒张末期停止搏动，之后迅速打开胸腔取出心脏，冷生理盐水冲洗后，将心脏外结缔组织、大血管以及心房取出，将右心室沿室间隔剪去，滤纸吸干后称取左心室质量(LVAM)，计算左心室质量指数(LVMI)：LVMI=LVMI/大鼠体质量。

1.8 心肌能量代谢指标检测

取各组中剩余的5只大鼠断头法处死，迅速取出心肌组织冰上剪碎，行超声裂解，4 ℃ 13500 r/min离心30 min取上清液，按照试剂盒操作说明检测大鼠心肌组织中Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性，按每小时每毫克心肌组织内ATP酶催化ATP时所释放的1μmoL无机磷作为单个ATP酶的计量单位。使用ELISA方法检测3组大鼠心肌组织中ATP、AMP、FFA含量。

1.9 SIRT1/PGC-1α通路蛋白检测

Western blot法检测3组大鼠心肌组织中SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达。将采集到的标本研磨后加入蛋白缓冲液常规蛋白提取，BCA法进行定量分析。50μg的蛋白样品上样，SDS-PAGE电泳，通过蛋白电转到PVDF膜，在5%的脱脂奶粉TBST中避光封闭1 h，洗涤后加一抗稀释溶液(SIRT1、PGC-1α按照1∶1000比例进行稀释)，4 ℃过夜，洗涤后加二抗稀释溶液(SIRT1、PGC-1α按照1∶5000比例进行稀释)，温床中孵育1 h后再次洗涤，加入发光液ECL，曝光2～3次取重叠值。使用软件分析蛋白条带灰度值，将GAPDH设置为内参蛋白。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 病理组织学观察

图1示，空白组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌细胞形态、大小正常。模型组大鼠心肌纤维排列较为混乱，心肌细胞间质、管壁外明显可见有炎细胞浸润，心肌细胞增大。给药组心肌纤维排列相比较模型组整齐，部分心肌细胞形态、大小恢复正常，心肌细胞间质、管壁外仅有少量炎细胞浸润。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色比较(×100)

2.2 破格救心汤加减对大鼠心功能的影响

表1示，模型组大鼠LVEDD、HR高于空白组，LVEDD、LVEF、FS低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组大鼠LVEDD、HR低于模型组，LVEDD、LVEF、FS高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 破格救心汤加减对大鼠心功能的影响

2.3 破格救心汤对大鼠血流动力学的影响

表2示，模型组大鼠LVMI、LVEDP高于空白组，+dp/dt、-dp/dt低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组大鼠LVMI、LVEDP低于模型组，+dp/dt、-dp/dt高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 破格救心汤对大鼠血流动力学的影响

2.4 破格救心汤加减对大鼠心肌能量代谢的影响

表3示，模型组大鼠心肌组织中ATP含量、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性低于空白组，AMP、FFA、AMP/ATP高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组大鼠心肌组织中ATP含量、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性高于模型组，AMP、FFA、AMP/ATP低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 破格救心汤加减对大鼠心肌能量代谢的影响

2.5 破格救心汤加减对大鼠心肌组织中SIRT1/PGC-1α通路蛋白的影响

表4图2示，模型组大鼠心肌组织中SIRT1、PGC-1α蛋白表达量低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组大鼠心肌组织中SIRT1、PGC-1α蛋白表达量高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 破格救心汤加减对大鼠心肌细胞中SIRT1/PGC-1α通路蛋白的影响

图2 Sirt1/PGC-1α通路蛋白WB条带图

3 讨论

中医认为心力衰竭属于“水肿”“惊悸”“喘症”“心痹”等范畴。《金匮要略》中记载有“心水”病证，认为本虚标实为其病机，是由心气虚发展成为心阳虚、心阴虚以及心阴阳两虚等，而水饮、痰、瘀为标实，治疗心力衰竭应重视扶阳，并以温阳利水为治疗原则。破格救心汤源于《伤寒论》，由附子、干姜、炙甘草、高丽参或红参、生山茱萸肉、生龙骨、生牡蛎、磁石、麝香等组成，方中破格重用附子、麝香、山萸净肉，能在急性心力衰竭阳脱阴竭之时扶正固脱、回阳救逆、益阳和阴、开窍醒神并挽救生命[6-8]。本文研究显示，与空白组比较，心力衰竭模型大鼠心肌组织出现显著的病理表现，且心功能、血流动力学均表现异常，但运用破格救心汤加减治疗后的心力衰竭大鼠病理损伤得到显著恢复，心功能、血流动力学均得到显著改善。此结果说明破格救心汤加减可有效修复心力衰竭大鼠病理损伤，改善心功能和血流动力学。

临床研究发现，当心力衰竭发生后心肌能量代谢异常，其利用物发生改变，由利用脂肪酸变为首先利用葡萄糖，之后引发游离状脂肪酸堆积。一方面抑制线粒体、胞质酶体系、肌质网等活性，损伤线粒体功能、呼吸链；另一方面抑制糖酵解，两方面相互作用加剧心肌能量代谢障碍[9-11]。另外研究显示[12]，心肌能量代谢异常后心力衰竭患者机体脂肪酸代谢作用会明显下降，虽然在每克脂肪酸的代谢过程中会有较多的ATP产生，但此过程会消耗大量的氧影响糖酵解，当脂肪酸在缺氧的条件下发生氧化作用后，会对机体乳酸的形成产生促进作用，进而导致心肌细胞内H+浓度的异常升高，引发心肌细胞内Na+、Ca+的超负荷，进而加剧细胞损伤程度，最终导致心功能障碍。本文研究结果显示，与空白组比较，心力衰竭模型大鼠ATP含量、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性降低，而AMP、FFA含量升高，但运用破格救心汤加减之后的心力衰竭大鼠ATP含量、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性均升高，而AMP、FFA含量降低，此结果说明破格救心汤加减通过增加Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性改善心肌能量代谢。

SIRT1属于一种酵母染色质沉默子SIRT2的同源体1，是第三类组蛋白去乙酰化酶Sirtuins家族的重要成员，一方面与调节基因转录、沉默、细胞生长周期有关，另一方面SIRT1还可对心肌细胞能量代谢、细胞自噬、细胞死亡、血管生成等过程具有调节作用[13]。PGC-1α能够对线粒体生物合成产生促进作用，增强有氧呼吸，并与线粒体所参与的新陈代谢、心脏能量的生成过程有关[14]。SIRT1能够通过乙酰化作用将PGC-1α激活，促进线粒体生物合成，对线粒体功能进行调节，进而对心肌细胞能量障碍、心脏收缩、舒张功能进行调控，最终起到保护心肌的作用，说明SIRT1/PGC-1α通路所调控能量代谢在心血管疾病中有着重要的作用[15-16]。在本文研究中，对大鼠心肌组织中SIRT1/PGC-1α通路蛋白进行检测，结果显示运用破格救心汤加减治疗后，心力衰竭大鼠SIRT1/PGC-1α通路蛋白的异常表达显著得到改善，此结果说明破格救心汤加减可能是通过作用于SIRT1/PGC-1α通路，增加Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性，最终起到改善心肌能量代谢的作用。

综上所述，破格救心汤加减可显著改善心力衰竭大鼠心功能及心肌能量代谢，其机制可能与作用于SIRT1/PGC-1α信号通路，通过增加SIRT1活性对PGC-1α所介导的线粒体能量代谢有关。但因本文研究样本量较少，统计数据及研究结果可能会存在一定的偏倚，因此还需临床后续研究进一步证实。