6-姜烯酚改善db/db小鼠胰岛素敏感性研究*

王 猛，马 朋，靳雅倩，王同壮，张 军，姚 玲，曹文富△，王建伟△

(1.重庆医科大学中医药学院，重庆 400016； 2.重庆医科大学基础医学院，重庆 400016；3.重庆市中医药防治代谢性疾病重点实验室，重庆 400016)

2型糖尿病(T2DM)是一种影响全人类健康的慢性代谢性疾病，其特征是胰岛素分泌受损或胰岛素抵抗[1]。胰岛素抵抗是指各种原因导致葡萄糖摄取和利用效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症的一种病理学状态。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2型糖尿病，常常出现肝、肌肉和脂肪组织对胰岛素刺激的不敏感[2]。考虑到肝脏在糖脂代谢中发挥的关键作用，肝胰岛素抵抗被称为中央胰岛素抵抗，是全身胰岛素抵抗和代谢综合征发生发展的重要诱导因素[3]。

生姜在2000多年前就被应用于治疗各种疾病，中医认为生姜性辛、微温，归肺、脾、胃经，具有调理肺胃功能、促进津液运行输布的作用。现代研究证实，生姜能降低糖尿病患者胰岛素、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，改善胰岛素敏感性[4]。6-姜烯酚是生姜中主要成分6-姜酚脱水形成的烷基酚类化合物，具有改善老年大鼠脂肪组织胰岛素敏感性的作用[5]。在此基础上，本研究进一步观察其对db/db糖尿病小鼠肝脏组织胰岛素敏感性的影响，并探讨其可能的作用机制。本研究已通过重庆医科大学实验动物中心伦理委员会审查。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级db/db 小鼠 (BKS-Leprem2Cd479/Gpt)和BKS小鼠 (雌雄各半)，11周龄，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，实验动物许可证号SCXK (苏)2018-0008。

1.2 主要试剂与仪器

6-姜烯酚 (日本京都大学 Pharma food 研究所馈赠，纯度≥98 %)；阿拉伯胶 (上海生物工程有限公司，批号MC0124B1013 J)；甘油三酯检测试剂盒 (南京建成，批号2018040017)；血浆胰岛素测定试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司，批号MM-0579M1)；葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司，批号20171004147)；M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (宝日医生物技术有限公司，批号RR047 A)；SYBR®Premix Ex Taq II 试剂 (宝日医生物技术有限公司，批号RR820 L)；异氟烷 (深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号217180801)；PGC1-α抗体 (稀释比例1∶1000，上海艾博抗贸易有限公司，批号AB54481)；GLUT2抗体(稀释比例1∶1000，美国Santa Cruz生物技术公司，批号SC9117)；GAPDH (美国ImmunoWay生物技术公司，批号YM3029)。

SynergyTMHTX 全自动酶标仪 (美国Bio Tek公司)；Mini-PROTEAN®Tetra System 垂直电泳装置、湿转印仪 (美国Bio-Rad公司)；Odyssey®Fc双色红外荧光成像系统 (美国 LI-COR 公司)；CFX96 Touch RT-PCR仪 (美国Bio-Rad公司)；icEN-24R高速冷冻离心机(杭州奥盛仪器有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组及处理

取db/db小鼠24只，饲养于重庆医科大学实验动物中心，温度21±1 ℃，相对湿度55±5%，12 h/12 h 明暗交替，自由摄食饮水。适应性喂养7 d后随机分为db/db 小鼠模型组 (db/db, n=8, 雌雄各半)、db/db小鼠6-姜烯酚低剂量组 (SL, 10 mg/kg, n=8, 雌雄各4只)、db/db小鼠6-姜烯酚高剂量组 (SH, 40 mg/kg, n=8, 雌雄各4只)，另取BKS小鼠适应性喂养7 d后作为正常对照组 (BKS, n=8, 雌雄各4只)。正常对照组及疾病模型组每日按体质量10 mL/kg给予5%阿拉伯胶灌胃，6-姜烯酚药物组将药溶于5 %阿拉伯胶中，按照10 mL·kg-1灌胃，每天给药1次。各组均给予正常饮食、饮水，每2 d记录进食量，每3 d记录体质量。实验21天结束后处死取肝脏称重，立即液氮冻存，后转移至-80 ℃保存，用于蛋白和基因的检测。

2.2 生化检测

实验第2周末，所有小鼠禁食过夜12 h，麻醉后于眼眶后静脉丛取血。然后给予40%浓度葡萄糖按10 ml/kg剂量灌胃处理，分别于20 min、60 min、120 min眼眶静脉丛取血，4 ℃ 3000 r/pm，离心15 min，取血浆放入-20 ℃冰箱中冻存备用，使用试剂盒测定禁食血浆葡萄糖、胰岛素及各时间段血糖水平，具体操作严格按照相关说明书进行。计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感性指数(HOMA-IS)。

计算公式: HOMA-IR指数=FBG(空腹血糖水平)(mmol/L)× FINS(空腹胰岛素水平)(mIU/L)/22.5；HOMA-IS指数=1/HOMA-IR指数。

肝脏甘油三酯(TG)检测：取肝脏组织适量(60 mg左右)，加入定量异丙醇(异丙醇=50 mg：1 mL)按照比例加入异丙醇匀浆，4 ℃振荡过夜，次日3000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清测定TG含量，具体操作严格按照说明书进行。

2.3 RT-PCR检测

Trizol法提取总 mRNA，参考反转录试剂盒说明书进行去基因组反转录，以 β-actin 为内参进行检测(引物如表1所示)。

表1 RT-PCR 相关基因引物序列(5′到 3′)

2.4 Western blot 检测

RIPA法提取肝脏总蛋白，BCA法检测浓度，调浓度至3μg/μL，每样本10 μL进行PAGE-SDS凝胶电泳，依照分子量不同250 mA 恒流电转相应时间，5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，室温孵育相应二抗，TBST洗膜，ECL发光液进行化学发光。Image J软件统计条带灰度值。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 6-姜烯酚对db/db小鼠一般参数的影响

结果显示，与BKS对照组比较，db/db模型组小鼠的摄食水平明显增高(P<0.05)；与模型组比较，6-姜烯酚低、高剂量组饮食水平差异无统计学意义(P=0.89，P=0.66)。图1示，6-姜烯酚未影响db/db小鼠的摄食量。与对照组比较，db/db小鼠的体质量和肝重均明显增加(P<0.05)，但6-姜烯酚用药组与模型组比较差异无统计学意义。

注：BKS(正常对照组，n=8)；db/db(模型组，n=8)；SL(6-姜烯酚低剂量组，10 mg/kg，n=8)；SH(6-姜烯酚高剂量组，40 mg/kg，n=8)；与BKS组比较：*P<0.05图1 6-姜烯酚对各组小鼠一般参数影响比较(A.进食量；B.体质量；C.肝重)

3.2 6-姜烯酚对db/db小鼠生化指标的影响

图2示，与BKS组比较，db/db模型组小鼠的禁食血浆葡萄糖、OGTT曲线下面积(AUC)均表现出明显的增高趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；与db/db模型组比较，6-姜烯酚低剂量组与高剂量组小鼠的血浆葡萄糖、OGTT曲线下面积(AUC)均表现出下降趋势，高剂量组小鼠下降趋势更加明显，但差异无统计学意义。与BKS对照组比较，db/db模型组小鼠的禁食血浆胰岛素、HOMA-IR、肝脏TG含量均明显升高(P<0.05)，HOMA-IS指数明显降低(P<0.05)；与db/db模型组比较，6-姜烯酚高剂量组小鼠的禁食血浆胰岛素、HOMA-IR指数、肝脏TG含量显著降低(P<0.05)，HOMA-IS指数升高(P<0.05)，但6-姜烯酚低剂量组小鼠未有明显的改善效果(P>0.05)。

注：BKS(正常对照组，n=8)；db/db(模型组，n=8)；SL(6-姜烯酚低剂量组，10 mg/kg，n=8)；SH(6-姜烯酚高剂量组，40 mg/kg，n=8)；与BKS组比较：*P<0.05；与db/db模型组比较；#P<0.05(A.禁食血糖;B.OGTT试验结果;C.OGTT曲线下面积；D.禁食血浆胰岛素；E.HOMA-IR指数；F.HOMA-IS指数；G.肝脏甘油三酯含量)图2 6-姜烯酚对 db/db小鼠生化指标影响比较

3.3 6-姜烯酚对 db/db小鼠肝脏糖异生相关基因表达的影响

由于6-姜烯酚高剂量用药组作用效果明显，所以只进行了BKS对照组、db/db模型组与高剂量用药组的肝脏胰岛素抵抗相关基因与蛋白的检测。图3示，与BKS对照组比较，db/db模型组小鼠的G6PC、PEPCK表达明显升高(P<0.05)；与db/db模型组比较，6-姜烯酚高剂量组小鼠的G6PC、PEPCK表达显著降低(P<0.05)。

注： BKS(正常对照组，n=8)；db/db(模型组，n=8)；SH(6-姜烯酚高剂量组，40 mg/kg，n=8)；与BKS组比较：*P<0.05；与db/db模型组比较：#P<0.05(A.肝脏G6PC基因表达水平；B.肝脏PEPCK基因表达水平)图3 6-姜烯酚对db/db小鼠肝脏糖异生相关基因影响比较

3.4 6-姜烯酚对 db/db小鼠肝脏胰岛素抵抗相关蛋白表达的影响

图4示，与BKS对照组比较，db/db小鼠模型组的PGC1-α、GLUT2表现出明显表达量的下降(P<0.05)；与db/db小鼠模型组比较，6-姜烯酚高剂量组小鼠的PGC1-α、GLUT2的表达水平显著升高(P<0.05)。

注：BKS(正常对照组，n=8)；db/db(模型组，n=8)；SH(6-姜烯酚高剂量组，40 mg/kg，n=8)；与BKS组比较：*P<0.05；与db/db模型组比较：#P<0.05(A.Western Blotting结果；B.肝脏GLUT2蛋白表达水平；C.肝脏PGC1-α蛋白表达水平)图4 6-姜烯酚对db/db小鼠肝脏胰岛素抵抗相关蛋白影响比较

4 讨论

胰岛素抵抗属于中医学“脾瘅”等范畴，仝小林教授总结脾瘅病机与肥人素体脾虚所致水谷不化、痰湿蕴与中焦密切相关[6]。生姜入肺、脾、胃经，其辛散之力强可助肺、脾、胃输布精微物质至全身，使痰湿得化，中满得消。如《雷公炮制药性解》[7]所述：“生姜辛入肺，肺得所胜，则气通宣畅……中焦之元气定，而脾胃出纳之令行。”糖是水谷精微的一种，而胰岛素抵抗状态常常表现为糖异生、转运及利用的障碍，即水谷精微的输布、转化失常。因此，生姜很可能通过调节精微物质即糖的异生、转运及利用等诸多环节，从而改善胰岛素的敏感性。基于此，本研究以糖尿病db/db小鼠为模型动物，从对糖异生通路和GLUT2的影响来探讨生姜的主要活性成分6-姜烯酚，改善胰岛素抵抗的作用及机制。

胰岛素抵抗体现了机体对胰岛素敏感性的下降，所以常常伴随着高血糖症及高胰岛素血症。研究结果显示，db/db糖尿病小鼠模型组的血浆葡萄糖、胰岛素水平及HOMA-IR相比对照组明显上升，HOMA-IS降低，表明其存在胰岛素敏感性下降。高剂量的6-姜烯酚干预明显降低了这些指标参数，提示6-姜烯酚改善了db/db糖尿病小鼠的胰岛素敏感性。

众所周知，糖异生是生物体将多种非糖物质转变成葡萄糖或糖原的过程。在哺乳动物中，肝是糖异生的主要器官。正常情况下，肝葡萄糖生成量约占内源性葡萄糖生成量的90%，这对于全身性葡萄糖稳态至关重要[8]。肝脏中胰高血糖素和胰岛素信号通路的正常活动，对于控制肝葡萄糖的产生起着关键作用。胰高血糖素可以通过激活与FoxO1密切作用的PGC-1α，从而进一步激活糖异生中的关键基因(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK和葡萄糖-6-磷酸酶G6Pase)[9-13]，以促进肝脏葡萄糖的形成。高血糖状态则会激活胰岛细胞产生胰岛素，通过降低PEPCK和G6Pase的活性抑制糖异生途径，从而调节血糖至正常水平。但胰岛素信号通路的受损会导致糖异生调节途径异常，从而病理性地出现糖异生关键基因(PEPCK和G6PC)的表达增高，血糖水平不受胰岛素控制，表现出胰岛素敏感性降低并产生胰岛素抵抗。有研究发现，2型糖尿病患者表现出PGC1-α活性的降低，这可能与线粒体功能障碍有关[14-15]。PGC1-α是线粒体生成的核心调控因子[16]，已有研究证明，其在大鼠骨骼肌中被激活可以预防线粒体功能障碍和胰岛素抵抗[17]。本研究结果显示，与BKS正常对照组比较，db/db糖尿病小鼠的PEPCK和G6PC蛋白表达量增高，同时存在PGC1-α活性的降低，结合其血浆葡萄糖、胰岛素水平及HOMA-IR的上升，反映了db/db小鼠肝脏组织存在着糖异生调节途径的受损及胰岛素抵抗，与研究报道一致。经过6-姜烯酚的处理，逆转了db/db小鼠PEPCK和G6PC的高表达，增加了PGC1-α的活性，提示6-姜烯酚改善db/db糖尿病小鼠的胰岛素敏感性可能与调节糖异生通路相关的PEPCK、G6PC和PGC1-α蛋白表达水平有关。

目前认为，胰岛素信号途径的受损是胰岛素抵抗发生的关键机制，其中IRS1/IRS2/Akt/GLUT2是重要靶标[18-20]。GLUT2作为葡萄糖转运体家族的一员，其肝脏组织的高表达能改善肝葡萄糖摄取和利用，从而改善高血糖状态[21]。亦有研究证明，GLUT2表达的增高可以产生对胰岛素抵抗的抑制作用[22]，并且改善了肝脏的脂质沉积。本研究结果显示，与BKS正常对照组比较，db/db糖尿病小鼠模型组肝脏甘油三酯含量表现出较明显的升高，同时伴随着GLUT2活性的降低，高剂量的6-姜烯酚明显逆转了这一趋势，提示6-姜烯酚可能通过调节GLUT2通路促进肝脏葡萄糖的摄取与利用，进而改善胰岛素敏感性。

综上所述，6-姜烯酚能够改善db/db糖尿病小鼠肝脏胰岛素敏感性，可能与抑制糖异生通路、促进葡萄糖转运与利用密切相关。