不同提取法对发酵灵芝菌粉提取物含量的差异分析*

余 蕾，阎光宇

(厦门海洋职业技术学院海洋生物学院,福建 厦门 361012)

引言

灵芝是一种树生菌类，是中国著名的药用真菌之一，在中国作为治疗性药草具有超过两千年的使用历史.在中医领域内，灵芝具有补气安神、止咳平喘等保养功效.不仅如此，灵芝对于多种理化以及生物因素引起的肝损伤、心血管疾病都起到很好的治疗和保护作用，也可以减轻非胰岛素依赖型糖尿病的发病程度.为了提升灵芝的医用价值，改善药用口感，通常使用生物工程技术，在酶的催化作用下，对灵芝进行酶解发酵处理，并将其制成发酵灵芝菌粉，方便加工食用[1].灵芝经过发酵与研磨处理，可以使灵芝孢子外壳变得柔软，孢子不易渗出、不易氧化.在应用过程中，为了达到更好的治疗效果会使用提取工艺，生成发酵灵芝菌粉的提取物，相比正常的发酵灵芝菌粉其纯度更高、治疗效果更好，发酵灵芝菌粉提取物可以制成中成药.在保证病人灵芝摄入量的情况下，简化加工过程.现阶段市面上使用与售卖的发酵灵芝菌粉提取物都是使用冷提取方法得到的，使用这种方法得到的提取物可以保证各个成分含量均衡，符合大多数人的需求[2].除了冷提取法以外，还存在热提取、碱法提取等多种方法，使用不同的提取方法得到的提取物中的成分侧重点不同，含量也不相同.然而针对不同的需求，需要用到不同的提取方法，对于一些有特殊要求的用户，需要为其定制其他的提取方法.因此，需要研究不同的发酵灵芝菌粉提取方法对提取物产生什么样的影响.

现如今普遍的含量差异分析方法有基于主成分分析的含量差异分析方法、基于FTIR的含量分析方法和基于柱前衍生化HPLC的含量分析方法[3].经过一段时间的研究发现，现有的含量差异分析方法用于发酵灵芝菌粉提取物含量分析时，会出现分析不准确、分析结果可信度低的问题，因此，需要对传统的含量差异分析方法进行改进设计，主要针对发酵灵芝菌粉提取物含量，从而得到具有科学权威性的分析结果.

1 发酵灵芝菌粉提取物含量差异分析方法设计

对不同提取方法下发酵灵芝粉提取物进行含量差异分析，首先需要选用灵芝原料，安装提取仪器，并使用灵芝原料在不同的提取方法下，得到提取结果[4].对得到的提取物进行预处理，测定提取物中的含量类型.在统计学方法的分析下，得到提取物含量的差异对比结果.

1.1 获取灵芝菌粉提取原料

灵芝菌粉提取物主要是在灵芝液体发酵培养基中提取的，首先需要制作灵芝液体发酵培养基作为灵芝菌粉提取的原料.灵芝菌粉的发酵过程在气升式发酵器中进行，气升式发酵器的结构如图1所示.

图1 气升式发酵器结构图

将活化的灵芝分割成多个菌丝块，进行30 min以上的灭菌处理.处理完成后将其放入气升式发酵器当中，在灵芝发酵过程中多间歇或者连续加料，基质和溶氧尽可能均匀分散，以此来保证灵芝在其中各个位置的质量分数较为均匀[5].气升式发酵器中有较高的气含率和比气液接触界面，保证灵芝在其中具有较高的传质速率和溶氧效率.在气升式发酵器中连续发酵6 h后，再以10%的接种量接入到发酵培养基中.设定机械摇床的转速为150 r/min，将培养基放置在恒定温度为288 ℃的环境当中，继续培养6 h，得到灵芝菌粉发酵液.

1.2 安装发酵灵芝菌粉提取仪器

在灵芝菌粉发酵的过程中安装提取仪器，根据不同提取方法的使用要求，安装相对应的提取仪器.发酵灵芝菌粉的提取仪器包括：旋转蒸发仪、HPD-25固相萃取仪、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵、GZX-9076MBE 数显鼓风干燥箱、2004 型数显恒温水浴锅、超声波发射仪、JA5003 电子天平以及津滕 CG-17 抽滤机等仪器装置[6].其中旋转蒸发仪、HPD-25固相萃取仪、2004 型数显恒温水浴锅、超声波发射仪分别为不同提取方法对应的提取设备.而SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵是为灵芝菌粉的提取提供一个真空的环境，避免空气中的其他微生物混入到提取物当中.同理津滕 CG-17 抽滤机是对初步提取的提取物进行过滤处理，保证提取物达到相同的提取精度，而JA5003 电子天平用来测量提取物的质量，在提取物含量差异分析过程中，需要保证不同方法下提取物质量相同，使得提取物含量之间具有可比性.

1.3 不同灵芝菌粉提取方法

在准备好提取设备与提取原料的条件下，分别使用冷提、热提、碱法提取、超声提取以及有机溶剂回流提取五种不同的提取方法，得到不同的发酵灵芝菌粉提取物.

1.3.1 冷提

冷提是在常温情况下，对提取物进行萃取的方法.将准备完成的发酵灵芝菌粉培养液经过95%乙醇浸泡和抽滤，把得到的培养滤液放入旋转蒸发仪当中，得到浸膏后加入适量的蒸馏水，接着在HPD-25固相萃取仪中加入石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得石油醚和三氯甲烷部分多为色素且提取物含量较少故舍去，其余部分冷冻干燥后得到粉末状的发酵灵芝菌粉冷提取物[7].

1.3.2 热提

使用2004 型数显恒温水浴锅为热提取方法提供恒定的温度环境，将旋转蒸发仪放入恒温水浴锅当中，并按照冷提取方法将培养基放入其中，将得到的提取物经过GZX-9076MBE数显鼓风干燥箱得到提取物.

1.3.3 碱法提取

使用电子天平称相同质量的发酵灵芝菌粉培养液，在提取仪器中添加pH值为10的氢氧化钠碱液50 mL，在常温水域环境下，浸泡2 h，在浸泡过程中伴随匀速搅拌，在提取与浸泡过程中保持提取环境的pH值为10，将浸泡结果输出得到粗提取液[8].经过固相萃取柱纯化，得到提取样品液，并取 1 mL 样品液用甲醇稀释.

1.3.4 超声波提取

超声波提取需要利用超声波发射仪，在普通烧瓶中添加乙酸乙酯 40 mL，在恒温60 ℃的环境下启动超声波发射仪，连续发射30 min，得到提取粗液，取 1 mL 样品液用甲醇稀释至 100 mL输出超声波提取结果.

1.3.5 有机溶剂回流提取

在烧瓶中放入发酵灵芝菌粉培养液，添加乙酸乙酯40 mL，连接上回流装置，利用漏斗过滤，滤液浓缩得到粗提液[9].选取提取物液中的5 mL样品，通过 0.2 μm 微孔滤膜，输出的液体进行干燥处理，得到的粉末状固体即为发酵灵芝菌粉提取物.

对不同提取方法下的提取率进行计算，计算方法如式(1)所示.

(1)

式中m表示的是发酵灵芝菌粉提取物的质量，c为提取液的质量分数，单位为ug/mL，v为提取液的总体积.通过计算保证不同提取方法的提取率在95%以上，使用天平分别称取不同提取方法下的提取物各15 g进行预处理.

1.4 提取物预处理

称取相同质量的发酵灵芝菌粉提取物，加入正己烷10 mL，经过5 min的充分振荡，放置30 min等待分层.去除分层后的上层清液，使用氮气吹干，实现发酵灵芝菌粉甲酯化处理，得到固体预处理结果.

1.5 测定发酵灵芝菌粉提取物成分

使用色谱、紫外光谱和质谱检测方法测定发酵灵芝菌粉提取物成分，采用高效液相色谱-紫外分光光度法测定，选用的波长多为254 nm和260 nm[10].得到提取物的成分测定结果如图2、图3所示.

图2 HPLC色谱图

图3 质谱正负离子的紫外光谱图

通过成分测定可以看出，发酵灵芝菌粉提取物中主要含有氨基酸、多肽、一般化学成分、蛋白质、真菌溶菌酶，以及糖类(还原糖和多糖)、麦角甾醇、三萜类、香豆精甙、挥发油、硬脂酸、苯甲酸、生物碱、维生素B2及维生素C等；孢子还含甘露醇、海藻糖和天然活性成分：灵芝多糖、灵芝酸等成分[11].

1.6 提取物含量统计与差异对比

1.6.1 统计学方法

通过式(2)计算发酵灵芝菌粉提取物中各个成本低额含量.

(2)

式中y为发酵灵芝菌粉提取物中某成分的质量分数，m0为发酵培养物质量，mt为该成分的物质的量[12].采用SPSS 17．0统计软件进行统计数据分析，多组比较用单因素方差分析，两两比较用Dunnett-t检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异,有统计学意义.

1.6.2 含量差异对比结果分析

经过成分含量的计算得出五种提取方法的含量差异对比结果，如表1所示.

表1 提取物成分含量差异对比结果表 g·100-1·g-1

从表1中可以看出，冷提取方法提取物中各个成分含量比较均衡，热提取方法中氨基酸含量较高，而多糖和蛋白质等成分由于高温降解的影响含量较低.碱法提取方法中氨基酸的成分含量较低，蛋白质和多糖的成分含量较低.超声波提取方法和有机溶剂回流提取方法得到的提取物各个成分含量都较高，相比之下有机溶剂回流方法下的提取物灵芝酸含量最高.

2 性能测试实验分析

为了验证差异分析方法的有效性进行了性能测试实验，选用相同的灵芝提取物作为性能测试实验的实验对象.为了更加鲜明的体现设计出的发酵灵芝菌粉提取物含量差异分析方法的性能，设置传统的提取物含量差异分析方法作为实验的对比方法.在性能测试实验当中，分别使用两种差异分析方法对相同情况下的提取物含量差异对比参数进行统计.在性能测试实验当中设置标准的实验差异参数，并计算两种分析方法得出的差异结果与标准设置结果之间的误差，误差结果如图4所示.

图4 性能测试实验对比曲线

从图4中可以看出，针对不同的测试组别，得出的误差结果不同，然而传统差异分析方法得出的误差值始终高于设计出的发酵灵芝菌粉提取物含量差异分析方法.经过计算，传统的差异分析方法的平均误差值为3.24，而设计优化的含量差异分析方法的平均误差为1.97，相比之下误差降低了1.27，因此设计出的发酵灵芝菌粉提取物含量差异优化分析方法具有较高的有效性.

3 结论

通过所设计发酵灵芝菌粉提取物含量差异分析方法，得出准确的发酵灵芝菌粉提取物含量统计与差异对比结果，将设计方法用于发酵灵芝菌粉提取物含量分析当中，可以用不同的提取方法提取出不同含量需求的发酵灵芝菌粉提取物，这对于生物医疗事业具有辅助作用.