47份大白菜品种的遗传多样性研究

韩 睿,赵孟良,2,孙世英,任延靖,2

(1.青海大学 农林科学院，青海省蔬菜遗传与生理重点实验室,西宁 810016; 2.青海大学 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,西宁 810016)

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)属十字花科(Brassicaceae burnett)芸薹属(Brassica)两年生作物，原产中国北方，是消费量巨大且栽培历史悠久的主要蔬菜作物之一；其全国每年播种面积近266.7hm2，产值在600亿元以上，占全国蔬菜总播种面积的15%左右[1]。大白菜营养丰富，富含蛋白质、维生素、纤维素和矿物质等，具有养胃生津、利尿通便和清热解毒等功效。目前国内大白菜品种很多，根据叶球类型可分为桩型、筒型和头球型；根据叶球颜色可分为白色、黄色、橙色、橘红色和紫色[2]。据统计，市场上有50余种不同类型的白菜品种[1]。

针对大白菜品种的研究主要集中在品种的评价与鉴定方面。孟淑春等[3]对65份大白菜种质资源进行了研究，结果表明在绒毛、中肋色、中肋长度、叶球质量和叶长等性状间存在较大的极差；赵美华等[4]利用AFLP标记对41份山西大白菜进行遗传多样性分析，发现平头型大白菜遗传多样性最为丰富，短筒型遗传多样性最为狭窄；原静云等[5]利用33对SSR引物对49个大白菜自交系的遗传多样性进行研究，表明品种间的遗传距离变异为0～0.93；段丽丽等[6]利用30对SSR引物分析了46份大白菜品种的遗传多样性，认为等位基因多样性指数分布范围为0.485～0.817。吴锦国[7]对4个大白菜品种进行了比较试验，为广大农户按市场需求选择不同的大白菜品种提供科学依据。

综上，目前国内大白菜品种的研究大多数集中在品种的评价研究，而对于青海地区大白菜的引种栽培研究较少，且未见农艺性状与分子标记对引种后大白菜进行综合研究的报道，因此本试验通过引入47份内地大白菜品种到青海高原，对其引种栽培后进行农艺性状的调查，利用SSR分子标记研究引种大白菜品种间的亲缘关系，并综合分析农艺性状及分子标记结果以期筛选出适宜青海高原地区种植的大白菜品种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的47份大白菜品种信息见表1。所有材料于2019年6月18日育苗，7月23日定植于青海大学农林科学院园艺所试验基地，试验地栽培管理条件一致[8]。

表1 供试的47份大白菜材料Table 1 47 tested Chinese cabbage materials

1.2 试验方法

1.2.1 农艺性状调查 参照李锡香《白菜种质资源描述规范和数据标准》[9]的方法对所有白菜品种30个农艺性状进行调查分析，包括14个数量性状及16个质量性状。数量性状通过卷尺(精度0.1 cm)及游标卡尺(精度0.01 mm)进行测量测定；其中所涉及的相关质量性状进行赋值见表2。

1.2.2 病害调查 对成熟期白菜主要发生的软腐病、病毒病、黑点病等主要病害进行系统调查。根据小区单株病害叶面积及株数计算病情指数，按照0、1、3、5、7、9级的病害分级标准对所有病害进行统计，病情指数的计算公式如下：

病情指数(DI)= (该病级值×各级发病株数)/(最高级值×调查总株数)×100[10]

根据病情指数，将大白菜的抗病性分为5级，其中高抗(HR)：0<病情指数<5；抗病(R)：5<病情指数<20；中抗(MR)：20<病情指数<40；感病(S)：40<病情指数<60；高感(HS)：病情指数>60[11]。

1.2.3 SSR分子标记鉴定引种白菜间的亲缘关系 供试叶片无病虫害感染，经液氮迅速冷冻后-80 ℃保存，用于后续试验。用改良的CTAB法提取白菜叶片的基因组DNA[12]，用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及完整性，微量紫外分光光度计检测DNA浓度及质量，-20 ℃保存。

PCR扩增体系为：上下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix 5 μL，DNA 1 μL，加ddH2O补至10 μL。PCR扩增反应程序为：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃变性30 s，52～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环29次；72 ℃再延伸10 min。取1 μL PCR产物，经9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压220 V，时间70 min。硝酸银染色及碱性甲醛溶液显色，拍照保留并统计条带[13]。

1.3 数据处理

采用Excel 2017进行数据的统计整理，采用SPSS 20.0软件进行数据分析，包括多样性分析，主成分分析，隶属函数分析，以及相关性分析和基于UPGMA的系统聚类分析。

多样性分析公式：H′=-∑piInPi，式中Pi为某一性状在第i个级别出现的频率。

隶属函数计算公式[14]：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中Xi为指标测定值，Xmax、Xmin为所有参试材料某一指标的最大值和最小值。电泳条带用人工读带的方法，观察电泳结果，记录清晰可重复的条带，清晰且可重复的条带记为“1”，弱带且不重复或无条带出现记为“0”，形成“0、1”数据矩阵，统计扩增带总数和特异条带数目，计算多态性比率，利用SPSS 20.0软件构建白菜供试品种材料基于UPGMA的聚类系谱图。

2 结果与分析

2.1 供试白菜数量性状多样性分析

对14个数量性状的多样性分析可知(表2)，多样性指数(H′)主要分布于0.65～1.49，平均值为1.23，其中外叶宽最高，多样性指数为1.49，其次是株幅(1.47)和球叶数(1.45)，除此之外，株高、叶球横径、中肋长、单株总质量、净菜率共8项性状的多样性指数都超过平均值，而中肋厚和中心柱长的多样性指数小于1.00，分别为0.65和0.98。这些性状的变异系数分布于0.12～0.64，以中心柱长的变异系数最大，达到0.64，净菜率和株幅的变异差异较小，均为0.12。

表2 47份大白菜品种数量性状的多样性分析Table 2 Diversity analysis of quantity traits in 47 different Chinese cabbage varieties

2.2 大白菜质量性状多样性分析

对47份大白菜的16个质量性状分析表明，大部分质量性状均能体现出丰富的遗传多样性(表3)，结果表明多样性指数分布于0.42～2.04，平均值为1.11，其中多样性指数最大的性状是叶球形状(2.04)，说明供试的白菜叶球形状丰富；其中近圆球形的占比27%；其次是卵圆形，占15%；矮桩形占13%；剩余45%由炮弹形、短筒形、长筒形、高坛形、倒卵形和倒锥形组成。商品熟性的多样性指数为1.54，主要集中在中早熟、中熟品种，分别为35%和31%，抽薹性多样性指数为1.37，中熟抽薹的品种占42%，中晚熟抽薹品种占38%，抽薹期总体较集中，大多数白菜品种对青海秋季气温适应性较好。

表3 大白菜品种质量性状的分布与多样性Table 3 Distribution and diversity of quality traits in Chinese cabbage

(续表3 Continued table 3)

2.3 主成分分析

以特征值大于1.0为标准提取主成分，对47个品种白菜的14项数量性状进行主成分分析，提取4个综合指标，结果显示累计贡献率达到 74.2%(表4)，即4个复合指标可代表原始变量的大部分信息。第1主成分特征值为4.92，方差贡献率最大(35.13%)，主要包括株高(0.90)、外叶长(0.89)、叶球纵径(0.82)、叶球质量(0.78)、株幅(0.76)、单株总质量(0.75)，这6项指标占据着主导地位，主要反映了与形态相关的4项性状，以及与质量相关的2项性状；第2主成分主要包括中肋长(-0.713)、叶球横径(0.685)、球叶数(0.616)，特征值为2.71，方差贡献率为19.37%；其他主成分方差贡献率较小。

表4 大白菜性状的主成分分析Table 4 Principal component analysis table of Chinese cabbage characters

2.4 隶属函数分析

隶属函数是把多个性状综合起来在同一个系统中进行分析，反映品种的综合优良性状，是综合评价分析中的重要分析方法。47份白菜的隶属函数值均为0.18～0.53，‘天青78’和‘天津绿’均为0.53，‘京箭70’隶属函数均值达到0.50，这3个品种均为长筒状，有较高的株高，中肋长而不厚，半结球型，叶球较松散，单株总质量偏低，‘精纯胶蔬秋’‘津耘白75’和‘胶蔬秋季王’有较高的隶属函数值，均来自天津和山东的优良品种，而隶属函数值最低的‘碧玉’为0.18，‘碧玉’和‘早熟5号’属于早熟品种，在秋季气温降低后易出现抽薹现象，商品性较差。

2.5 47份白菜数量性状的相关性分析

对47份白菜品种的13个数量性状进行相关分析，得到各性状的相关系数矩阵，数据显示47个品种的性状之间存在不同程度的相关性。其中株高与外叶长极显著相关，相关系数为0.947，叶球质量决定单株质量的大小，相关系数达到 0.935。叶球纵径与株高呈极显著正相关，相关系数为0.861，外叶长与叶球纵径相关系数达 0.841，呈极显著正相关，同时，株幅与株高也呈极显著正相关(0.673)，株幅与外叶长和外叶开展度有关。植株的生长发育过程中，大白菜的株高、外叶长及叶球纵径之间紧密相关，因此可以由外叶长预估叶球的大小。

2.6 主要病害分析

对成熟期白菜病害情况进行统计，根据病斑面积对病情进行分级，利用公式计算各病害的病情指数(DI)。其中5个大白菜品种有低程度霜霉病，病情指数均小于20，属于抗病品种。有低程度感染黑斑病的有6个大白菜品种，病情指数小于20。软腐病中抗(MR)品种有‘高山娃娃菜’‘新域京56’和‘京春黄3号’；感病(S)品种为‘金抗678’，病情指数为46.46；‘春喜大白菜’病情指数达到80.00，属于高感(HS)品种，不宜种植，其余6个感染品种程度较轻，病情指数低于20，是抗病品种。‘大绿秋黄’有较严重的病毒病，根据病情指数51.52，被认为是感病(S)品种，造成严重的经济损失甚至绝产。‘金抗678’和‘京春黄3号’均有黑点病，病情指数分别为27.78和 32.41，属于中抗品种，黑点病对产量的影响较小，但对其商品性影响较大。

2.7 农艺性状聚类分析

依据30个性状数据，对47份白菜品种进行系统聚类分析，聚类图(图1)中在距离系数为10处，可将供试白菜分为5大类群。第Ⅰ类群可进一步分为2个亚群，第一个亚群包括16个品种，主要为中熟品种，叶球质量平均为2.15 kg，球叶数平均值达到65.31片，其中‘高山娃娃菜’球叶数平均值高达78.50；第二个亚群包括14个品种，均表现出中早熟性，叶球质量平均值为2.02 kg，球叶数平均为47.39片。第一亚群与第二亚群的叶球质量平均值差仅为0.13 kg，但球叶数平均值相差17.91，第一亚群中肋厚平均值为 7.79 mm，第二亚群的中肋厚平均值为8.82 mm，所以2个亚群在叶球外观大小差异并不大，分析其产生差距的原因，是第二类群凭借较高的叶片数和较厚的中肋增加质量。第Ⅱ类群包括‘碧玉’和‘15杂22B’2个品种，这2个品种在试验中表现出易抽薹，其商品性价值较低。第Ⅲ类群的8个品种内叶颜色均为黄色，所以聚为同一类群。这一类群的植株均为高产品种，叶球质量平均值达到2.88 kg，球叶数平均值为83.81片，其中‘京春娃3号’球叶数高达92.50片，但是叶球横纵径与第一、二类群接近，说明这些品种的叶球紧实，可作为高产稳产的品种进行筛选培育。第Ⅳ类群仅包含‘迷你金娃娃’1个品种，产地为河北，植株较小，属于娃娃菜品种，但其内叶颜色也为黄色，所以与第三类群属于同一分支。第Ⅴ类群6个品种形态特征相似，株高平均值达到 52.34 cm，叶球包心为圆直筒形，植株也呈直立型，叶型紧凑不向外蔓延伸展，叶片呈翠绿色。其中，由于‘京翠70’质量较小，成为单独的亚群，‘津耘白75’和‘天青78’ 形态最为相似为同一分支。

2.8 利用SSR分子标记分析白菜亲缘关系

2.8.1 SSR-PCR扩增结果 69对SSR引物中有52对引物能够扩增出具多态性好且清晰的条带，占供试引物的85.5%。在69个基因座位中共检测出200条清晰条带，多态性条带171条，各引物扩增条带数为1～8，平均为2.90条。其中Br02-6扩增出8条带，条带数目最多，Br04-5未扩增出条带，Br03-5、Br03-9、Br04-1、Br05-7、Br07-4、Br08-3、Br08-4和Br09-3扩增的多态性条带百分率达到100.0%。

引物Br02-6对47个大白菜品种的扩增图谱如图2。扩增得到的DNA片段长度约为100～500 bp。

2.8.2 SSR分子标记结果聚类分析 基于系统聚类法SSR鉴定结果(图3)，在距离系数为23.0处将47分大白菜分为5个类群，第Ⅰ类群包括32个品种，其中‘华耐B1102’‘春玉黄’和‘小宝大白菜’系谱图中分支最近，表明遗传背景最为相似；‘精纯胶蔬秋’和‘胶蔬秋季王’亲缘关系十分接近，经分析，这2个品种外形相似，来源地相同，可能有相同的父本或母本；‘京翠70’被划分为一个单独的群体(Ⅴ)；‘北京桔红’和‘春大强’划分为一类(Ⅳ)；‘津耘白75’等8个品种为第Ⅱ类群；第Ⅲ类群包含4个品种，分别是‘京箭70’ ‘京域新56’‘早熟5号’以及‘天青78’，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类群的白菜品种在系谱值为24时在同一分支，系统聚类结果显示，来源地接近的品种有较近的亲缘关系。

3 讨 论

中国是白菜类蔬菜的起源中心，在长期的自然选择和进化过程中，形成了很多变种，有着非常丰富的种质资源，而以往对这些资源的研究和利用大多围绕选育蔬菜品种而展开，同时，育种方向以高产稳产优质为主。因此，在调查植株农艺性状的选择上，以体现质量及品质的性状为主。

本试验对引种的47个品种大白菜进行农艺性状的分析及SSR分子标记分析，两类分析方法均使用相同的聚类方法分类，虽然聚类分析把多个种质基本分开，但大部分种质的分子标记与农艺性状的聚类结果一致性不高，吴丽艳等[15]对在云南试种的37份茄子资源进行相同的分析，研究结果表明其表型分析结果与分子标记分析结果相关性较低，这与本试验研究结果一致。本研究大白菜SSR标记分析的聚类关系没有明显规律，类群内相似程度较高，有一些不同地理来源的种质也聚合在一起，这可能是引物数量不够或者是种类不丰富引起的[16]，另外，也有可能是由于不同地域、不同品种间的基因交流频繁，从而导致不同品种群体间的遗传分化系数较低，遗传差异降低。所以，在今后研究中，有必要选择覆盖较大范围基因组的引物，以保证种质遗传多样性的评价更为有效。同时，应广泛搜集不同地域的试验材料来源进行对照试验，使试验结果更具普遍性。并用多种分子标记进行遗传多样性分析，可以同时反映出形态间和表观不体现的潜在核酸差异，分析结果更为准确[17]。

目前，亲缘关系的远近与品种来源地紧密相关，但传统的形态学分类结果与分子标记结果仍有差异，可能与材料内在基因表达受限或表达效应与外在形态关联不够紧密引起[18]。在近年来大白菜的选育中，亲本亲缘关系相近导致新品种亲缘关系相近，新品种的选育标准在高产优质的基础上应该更加多维，以增加遗传多样性。品种来源为山东、天津的大白菜在青海地区生长发育及综合品质性状优良，可能是山东和天津与青海东部种植区域纬度接近，日照时长统一，引种易成功[19]，但青海地区较天津、山东气候凉爽，昼夜温差大，上述品种适应性更强，所以叶球品质良好； 6-9月青海省降雨量和降雨日数均达到峰值[20]，夏秋季节气候较冷。本试验中，白菜经一个月育苗，7月23日定植于露地，10月22日开始调查农艺性状，成熟率达到80%，所以青海地区7月底可作为白菜定植最末期，适合春季播种的大白菜生长的有效温度(13 ℃<日温<22 ℃)的天数约90 d，适播期为4月下旬到6月初；收获期约为6月中旬到7月中旬，适宜作为反季节蔬菜，北菜南运[21]。

4 结 论

试验地位于青海省西宁市，属大陆性高原半干旱气候，全年降雨量主要集中在6-9月，占全年降水量的65%以上，日照时间较长，日照辐射强，日温差大，无霜期100～200 d。气候冷凉，适宜种植中晚熟抗旱、抗寒、不耐热的大白菜品种。本研究表明青海地区适宜种植筒状结球白菜，‘天津绿’和‘天青78’均为品质优异的品种，结球紧实，株幅较小可有效合理密植，且地区接受度较高。同时，球形的白菜品种如‘精纯胶蔬秋’结球紧实且抗病性高，易于管理，这些品种为高产稳产的中、晚熟品种，对试验地昼夜温差大以及长日照的条件有良好的适应性，是青海耕地地区适宜推广种植的白菜品种。大部分品种农艺性状聚类结果与分子标记聚类结果一致性较低，其表型差异与SSR遗传差异不一致，但仍可以通过SSR分子标记的方法快速鉴定区分大白菜品种。