禽流感和新城疫血凝抑制试验检测方法

摘要：血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HI）属兽医实验室检测禽流感、新城疫等家禽A类疫病常规方法，但在具体操作阶段，一旦操作不规范极有可能降低试验检测结果精准程度，弱化工作效率。该文主要论述禽流感和新城疫血凝抑制试验检测方法。

关键词：禽流感;新城疫;血凝抑制试验;检测方法

中图分类号：S855.3          文献标识码：B        doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.005

Methods of Hemagglutination Inhibition Test for Avian Influenza and Newcastle Disease

Abstract：Hemagglutination test （Ha） and hemagglutination inhibition test （Hi） are routine methods in veterinary laboratory to detect avian influenza and Newcastle disease，if the operation is not standardized enough，the accuracy of test results will be reduced and the work efficiency will be weakened.The methods of hemagglutination inhibition test for avian influenza and Newcastle disease were discussed in this paper.

Keywords：avian influenza，newcastle disease，hemagglutination inhibition test，detection method

引言

禽流感和新城疫是家禽养殖过程中的常见病，是重大禽类传染病之一。需做好家禽A类常见疫病的常规检测方法，但在实际操作中，易出现不规范的问题，降低了试验检测结果精准程度。提供一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，可克服现有技术不足，从根本上保证诊断技术检测结果精准程度。

1 采集与血样处理

1.1 红细胞准备

1%鸡红细胞悬液的制备包括用阿氏液作为抗凝剂，选择3只无特定病原微生物（SPF）、无禽流感症状、新城疫抗体的非免疫公鸡的抗凝血液作为研究对象，加入试管中，随即加入抗凝血液3倍的缓冲液（PBS）进行充分混合，离心速度保持在2 000 r/min，持续5～10 min，去除血浆、白细胞层，重复上述过程并反复冲洗3次，将血浆、白细胞清洗干净，离心速度控制为2 000 r/min，持续10 min，吸取适当的压积红细胞配合使用PBS制备质量分数为1%的鸡红细胞悬液，在恒温4 ℃条件下保存。选取2.05 g葡萄糖、0.8 g柠檬酸钠、0.055 g柠檬酸、0.42 g氯化钠加入100 mL的蒸馏水中，直至充分散热溶解，维持pH在6.1并充分溶解，在压强6.9 kPa条件下持续15 min高压灭菌，在恒温4 ℃条件下保存。配置的醛化红细胞液质量分数为0.75%，加入到浓度为0.1%，恒温4 ℃，吸取适当的压积红细胞配合使用PBS制备质量分数为1%的鸡红细胞悬液，在恒温4 ℃条件下保存。加入到浓度为0.1%的叠氮钠中备用。

1.2 血清准备

受检样品为山东望联种禽集团有限公司肉种鸡血清，原始编号为1～30，于2020年9月15日免疫高致病性禽流感三价灭活苗（H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9（H7-RE2株），青岛易邦生物工程有限公司，生产批号201384900;于2020年9月25日免疫新城疫冻干活疫苗，青岛易邦生物工程有限公司，生产批号200333110。

1.3 检测试剂准备

使用哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制试验抗原，生产批号20190415，血凝效价8log2，和青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131801;血凝效价为10log2。

1.4 检测方法

（1）设禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log2，设新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log2。

（2）配制禽流感参照血凝效价11log2或新城疫参照血凝效价12log2的4HAU抗原。

（3）取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1～15孔各加入0.025 mL PBS，第16孔加入0.05 mL PBS。

（4）第1孔中加入0.025 mL標准的禽流感、新城域阳性血清，经过充分混合后取出0.025 mL放置到第2孔中，直至第14孔，并且需要从第14孔中取出0.025 mL抛弃，第15孔作为阳性参照，第16孔作为PBS对照。

（5）1～15孔中均加入0.025 mL的L4HAU抗原，轻触反应板，实现反应物的充分混合，温度环境控制在20～25 ℃环境下静置，持续30 min，也可以选择在恒温4 ℃条件下持续静置1 h;20～25 ℃室温下静置35～45 min，或在恒温35～40 ℃条件下静置持续12～18 min，PBS与孔红细胞对比呈现出显著的钮扣形状沉积到底，此时判定结果。

1.5 判定结果

PBS正确的前提下，倾斜反应板，从背侧角度观察，1～3 s内观察红细胞是否以泪珠状落下，在阴性血清与标准抗原对照的HI滴度≤2log2的情况下，阳性血清和标准抗原进行对照，与已知滴度相差大约1个稀释度，在阴阳血清均不发生自凝的前提下，判定HI结果有效，记录试验抗体效价数值。

禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价=（试验抗体效价数值-Y）log2，Y=0、1、2、3、4。

新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log2比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价=（试验抗体效价数值-Y）log2，Y=0、1、2、3、4。

禽流感抗体效价公式或新城疫抗体效价公式中，若计算出的禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于10，则禽流感抗体效价或新城疫抗体效价记为10log2;若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价小于或等于3log2，则判定抗体试验为阴性;若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价等于4log2，则判定抗体试验为可疑，需重复试验;若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于或等于5log2，则判定抗体试验为阳性。

2种试剂检测出试验HI效价（log2）情况如下。

（1）禽流感病毒H7N9（RE-2株）试验HI效价（log2）按照原始编号（1-30）结果分别为12、11、11、12、12、13、11、11、12、12、11、12、12、12、11、13、12、11、12、11、13、13、12、11、12、11、12、12、13、11;根据禽流感抗体效价公式，11log2比正确血凝效价8log2多3个滴度（Y=3），抗体效价（log2）=试验抗体效价-3，求得禽流感病毒H7N9（RE-2株）HI效价（log2）按照原始编号（1-30）结果分别为9、8、8、9、9、10、8、8、9、9、8、9、9、9、8、10、9、8、9、8、10、10、9、8、9、8、9、9、10、8;

（2）新城疫血凝抑制试验抗原的试验HI效价（log2）按照原始编号（1～30）结果分别为12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、11、12、12、12、12、12、11、12、12;根据新城疫抗体效价公式，12log2比正确血凝效价10log2多2个滴度（Y=2），抗体效价（log2）=试验抗体效价-2，求得新城疫HI效价（log2）按照原始编号（1～30）结果分别为10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、9、10、10、10、10、10、9、10、10。

本检测方法和传统检测方法技术相比，在用于禽流感和新城疫血凝抑制试验检测方中经过大量试验证明修正后得到禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，设定11log2为禽流感参照血凝效价，设定12log2为新城疫固定的参照血凝效价，能够直接进行血凝抑制试验并运用禽流感、新城疫血凝抑制试验抗体效价公式，求得HI抗体效价，其结果与正确抗体效价完全一致[2]。

2 加样阶段注意事项

（1）取样环节。移液器要按至首个档停点，在排样阶段要求要按至第二档停点才能保证样品整体排出并保证取样量精准。

（2）吸液环节。去除吸头外部吸附的多余液体，拇指松开速度要平稳缓慢，不要出现快速松开的操作，要顺着沿壁滑出吸头。

（3）加样阶段。吸头与V板孔不应触及，以此减少交叉污染。按照比例稀释样品的过程中，拇指要缓慢按压松开移液器按钮。

（4）实际检测。对盛放抗原液的加样槽壁也要做出特殊标识[3]。

3 结论

采用血凝抑制试验（HI）检测禽流感与新城疫病毒會受到多种因素共同影响检测结果精确度，工作人员要在试验中严格控制试验条件，严格依据规范要求配置红细胞悬液，合理控制温度及时间，力争把影响降至最低。

参考文献

[1] 解慧梅，李伟伟，罗天雨，等.甪直地区鹅副黏病毒病的流行病学调查[J].甘肃科技，2019，35（12）：136-138.

[2] 任义品，韩渝濠.血凝抑制试验4单位抗原的配置方法探讨[J].养禽与禽病防治，2019，14（2）：10-11.

[3] 白文彬，于康震.动物传染病诊断学[M].北京：中国农业出版社，2002：128-132.

作者简介：李宇刚（1976-），男，山东威海人，本科，兽医师，研究方向：畜牧兽医。