胶体金免疫层析技术检测中兽药非法添加化学药品的应用

赵兴鑫　田梅　赵义良　苏青　吕洁　赵永坡　张吉

摘要：为快速有效地鉴定出中兽药中非法添加的化学药物，该文选取健胃散、白头翁散、银翘解散和清瘟败毒散4种常见的中兽药散剂作为基质，分别添加不同浓度的沙丁胺醇和克伦特罗2种“瘦肉精”药物，及氯霉素和四环素2种抗生素药物，建立胶体金快速检测方法。结果表明，在健胃散、白头翁散、银翘解散中添加10 μg/kg沙丁胺醇对照品，各个加标样品检测结果均为阳性;在清瘟败毒散中分别添加2、3、5 μg/kg克伦特罗对照品，各个加标样品检测结果均为阳性，且有一定梯度;在健胃散、白头翁散、银翘解毒散中添加10 μg/kg氯霉素对照品，各个加标样品检测结果均为阳性;在健胃散、白头翁散、银翘解毒散中添加50 μg/kg四环素对照品，各个加标样品检测结果均为阳性。

关键词：中兽药;瘦肉精;抗生素;快检;胶体金

中图分类号：S853          文献标识码：B        doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.001

Detection of Illegally Added Chemicals in Chinese Veterinary Drugs Based on Colloidal Gold Immunochromatography

Abstract：In order to quickly and effectively identify the illegally added chemical drugs in Chinese veterinary drugs，four common Chinese veterinary drugs，Jianwei powder，Baitouweng powder，Yinqiao powder and Qingwen Paidu powder，were selected as the substrates，the colloidal gold method was established by adding different concentrations of salbutamol and Clenbuterol，chloramphenicol and tetracycline，respectively.The experimental results showed that 10 μg / kg salbutamol reference substance was added to Jianwei powder，Pulsatilla powder and yinqiao powder，and the test results of each spiked sample were positive;2，3 and 5 μg/kg clenbuterol control samples were added to Qingwen Baidu powder respectively，and the test results of each spiked sample were positive with a certain gradient;10 μg/ kg chloramphenicol reference substance was added to Jianwei powder，Pulsatilla powder and Yinqiao Jiedu powder，and the test results of each spiked sample were positive;50 μg/kg tetracycline reference substance was added to Jianwei powder，pulsatilla powder and Yinqiao Jiedu powder，and the test results of each spiked sample were positive.

Keywords：Chinese veterinary medicine，clenbuterol，antibiotics，rapid detection，colloidal gold

引言

隨着全社会对食品安全问题的重视，在我国畜牧业领域进一步提出新的发展要求，其中在兽医临床中减少使用或代替化学合成类抗生素等药物成为最重要的措施[1]，而中兽药因具有低毒副作用、不易产生耐药性等优点会越来越被广泛地应用。

胶体金免疫层析法在具体检验期间所用原理为竞争抑制免疫层析，检验所用样品中待测物在流动时结合胶体金标记特异性待测物单克隆抗体，对于抗体及硝酸纤维素膜检测线上应用的待测物-BSA偶联物结合产生一定的抑制效果，从而造成检测线颜色发生不同程度的深浅变化[2]。当样品中不含有待测物或浓度低于检测限时，T线（测试线，testline）显色强于C线（质控线，controlline），或者显色与C线显色之间未见明显差异，如果和检测限进行比较，样品中的待测物浓度较高，则T线显色会明显弱于C线显色，或者也表现为T线不显色。

为了快速检测出中兽药中的违法添加物，拟通过胶体金免疫层析法，开展违法添加物的快速筛查检测工作，通过与深圳市绿诗源生物技术有限公司联合开展技术攻关，得到了适用于中兽药中违法添加物快速筛查检测的胶体金速测卡。

1 仪器与材料

沙丁胺醇、克伦特罗、氯霉素、四环素胶体金快速检测卡（深圳市绿诗源生物技术有限公司），漩涡混合仪，离心机。实验用样本提取液（深圳市绿诗源生物技术有限公司），沙丁胺醇、克伦特罗、氯霉素、四环素对照品，健胃散、白头翁散、银翘解散和清瘟败毒散。

2 方法

取样品（1±0.01）g，放入50 mL离心管中，加入40 mL样本提取液，漩涡混合2 min，室温下4 000 r/min离心5 min。取上清液2～3滴加入检测卡样品孔中，计时5 min后，直接目测结果。

3 结果与分析

3.1 基質干扰考察

胶体金免疫层析法对样本的处理是有一定要求的，由于免疫反应是一种生物反应，最终滴加入检测卡孔中的液体pH要在一定范围内，通常为5～8，否则容易出现假阳性或无效的情况;而中兽药散剂本身物质成分复杂，又具有较深的颜色，易造成干扰。在预实验时针对样本提取液（一定浓度的缓冲体系）和稀释倍数做大量研究，最终确定该方法。可通过图片清晰地看到健胃散、白头翁散、银翘解散和清瘟败毒散在基质状态下试纸条显示明显的阴性，偶有淡黄色背景，但不影响结果判断[3]。

3.2 加标实验

健胃散、白头翁散、银翘解散，分别称取1 g，定量加入0.01 mL沙丁胺醇（1 μg/mL）对照品，所添加对照品剂量与中药散剂含量10 μg/kg相当，按照应用“2”方法处理分析，检测所用工具为胶体金免疫层析检测卡，分别记录结果，见图1，各个加标样品检测结果均为阳性，表明方法准确性良好。

分别称取3份清瘟败毒散各1 g，依次定量加入克伦特罗（0.1 μg/mL）对照品0.02、0.03、0.05 mL，相当于中药散剂含量为2、3、5 μg/kg，按“2”方法处理后，应用胶体金免疫层析检测卡进行检测，分别记录结果，见图2，各个加标样品检测结果均为阳性，且有一定梯度，表明方法准确性良好。

健胃散、白头翁散、银翘解毒散，分别称取1 g，定量加入0.01 mL氯霉素（1 μg/mL）对照品，所添加对照品剂量相当于中药散剂含量10 μg/kg，所用处理方式同样为“2”方法，然后借助于胶体金免疫层析检测卡展开检测，分别记录结果，见图3，各个加标样品检测结果均为阳性，表明方法准确性良好。

健胃散、白头翁散、银翘解毒散，分别称取1 g，定量加入四环素（10 μg/mL）对照品，添加剂量为0.005 mL，与中药散剂含量50 μg/kg相同，处理时应用“2”方法，所用检测工具为胶体金免疫层析检测卡，分别记录结果，见图4，各个加标样品检测结果均为阳性，表明方法准确性良好[4]。

4 讨论

健胃散、白头翁散、银翘解散和清瘟败毒散4种中兽药散剂在本实验方法下检测未出现假阳性或无效的情况，说明该方法的提取溶剂和稀释倍数适合，减少色素及其他杂质的影响。在加入的药物对照品的样品中，均有检出，呈现明显的阳性结果，且检测限均达到痕量级别，更进一步确保检测结果的准确性。

该方法的优势十分明显，在具体应用期间所得检测项目灵敏度与其他检测手段可媲美，在实际应用期间可提前检测大量样本以及多个靶标物质，有利于进行违法行为的初步判定。胶体金免疫层析法主要优势在于操作简单、省时省力，和传统方法进行比较，应用期间对于仪器设备要求较少，且检测费用较低，所获得的检测结果直观，适合基层条件下使用，具有广阔的发展空间。

中兽药散剂品类众多，成分复杂，且在种植及炮制时有差异，而胶体金免疫技术易受样本基质干扰，如样品本身色素较多、pH值过低或过高、相似结构的杂质成分等因素，易出现假阳性或无效情况。为解决此类问题，需要调配合适的提取溶剂和调整合适的稀释倍数来降低基质干扰。

5 结束语

胶体金快速检测技术已经被广泛使用在食源性动物的快速筛查上，技术成熟，商业化生产企业众多。随着相关部门对兽药处方外非法添加的监管与打击力度不断加大，积极推进快检方法的应用和适用范围扩展。对中兽药非法添加化学药物进行快速有效地分析，提高各检测机构的筛查能力，胶体金免疫层析技术是一种净化中兽药市场的可靠手段。

参考文献

[1] 李明.我国兽药产业现状与发展趋势[J].兽医导刊，2018（19）：14-15.

[2] 李耀磊，刘丽娜，姚云，等.基于胶体金免疫层析技术对中药材中黄曲霉毒素B_1的定量检测研究[J].中国药学杂志，2019，54（17）：1 432-1 437.

[3] 周媛，贡玉清，邵德佳.有关中兽药中非法添加化学药物的探讨[J].中国畜牧兽医文摘，2010，26（5）：36-37.

[4] 蒋海芬，韦励平，韦俏娜.兽药中非法添加物检测新技术的应用[J].广西畜牧兽医，2015，32（2）：109-110.

基金项目：石家庄市科学技术研究与发展计划项目（201500122A）;石家庄市科技创新团队项目（208790026A）

作者简介：赵兴鑫（1985-），男，汉族，山东泰安人，硕士研究生，高级畜牧师，从事畜产品和兽药饲料质量安全检测方法的研究工作。