川芎-防风药对通过抗氧化改善大鼠脑缺血再灌注损伤

毛明江，李秋颖，郑燕飞，翁志伟，罗 杰，郭 莹

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

缺血性脑卒中具有发病率高等特点，是导致死亡和长期致残的主要原因之一［1]，给家庭和社会带来沉重的负担［2]，因此，探寻治疗脑缺血的有效药物迫在眉睫。中医多以中药配伍的形式进行疾病的防治［3-4]，药对是最简单的中药配伍形式，被历代医家广泛应用。近年来，在脑缺血损伤的防治研究中发现，中药药对的合理运用，可实现中药复方的优化组合，明显减轻缺血半暗带脑组织的损伤以及脑缺血再灌注引起的损伤［5-6]。

川芎（Ligusticum wallichii）具有活血化瘀［7]、抗氧化、神经保护［8]等作用，广泛用于脑缺血的治疗，疗效确切。防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schisck 的干燥块根，具有解表祛风、抗炎抗菌、活血化瘀［9]、抗氧化［10]等作用。前期研究中，对中华医典5.0 系统中治疗脑中风的古代方剂进行频数分析和关联分析，川芎-防风为古代治疗脑中风的最常用药对之一［11]。目前对于川芎-防风药对配伍治疗脑中风的实验研究尚未见报道，两者是否存在协同作用？协同作用机制如何？是目前要探究的关键问题。本研究从川芎-防风药对体外抗氧化及体内抗脑缺血性损伤两方面开展实验，探究两者是否通过清除自由基和抗氧化作用协同起效。

1 材料

1.1 动物 SPF 级SD 大鼠，雄性，体质量（280±20）g，购自浙江中医药大学动物实验研究中心，实验动物使用许可证号SYXK（浙）2018-0012。

1.2 药物与试剂 川芎、防风（浙江天道医药有限公司；批号分别为181003、180902）；95%乙醇（无锡市晶科化工有限公司，分析纯，批号20170502）；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，上海 源叶生物科技有限公司，批号W10A8E33599）；超氧化物歧化酶（SOD，批号20181029）、丙二醛（MDA，批号20181029）、乳酸（LD，批号20181107）、乳酸脱氢酶（LDH，批号20181031）、蛋白定量检测试剂盒（批号20181018）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC，批号BCBR5462）均购自南京建成生物工程研究所；其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器 HWS26 电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52 旋转蒸发器（上海嘉鹏科技有限公司）；Spectra Max M3 酶标仪（美国MD 公司）。

2 方法

2.1 川芎、防风单用及合用对DPPH 自由基清除率的影响

2.1.1 供试品溶液的配制 精密称取川芎、防风单煎及合煎所用药材5 g，单煎和合煎组中川芎和防风的质量配比分别为0∶1、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶0，分别加入70% 乙醇50 mL，80 ℃回流提取1 h，滤过，即得（0.1 g/mL）。

2.1.2 DPPH 自由基清除率测定 分别精密移取“2.1.1”中的供试品溶液800 μL，加入70%乙醇至2 mL，混匀，稀释2.5 倍，精密移取20 μL 于96 孔板中，再加入180 μL 50 mg/mL DPPH 溶液，以70%乙醇作空白对照，避光反应30 min，于517 nm 处测定吸光度，计算清除率，公式为［（OD2-OD1）/（OD2-0.036）] ×100%，其中OD1为样品与DPPH 反应后在517 nm 处的吸光度，OD2为70%乙醇与DPPH 反应后在517 nm 处的吸光度。

2.1.3 精密度试验 精密移取上述供试品溶液各20 μL，加入DPPH，按“2.1.2”项下方法于517 nm 波长处测定吸光度，计算清除率，结果见表1，可知仪器精密度良好。

表1 酶标法精密度试验结果

2.1.4 稳定性试验 精密移取上述供试品溶液各20 μL，于0、2、4、6 h 按“2.1.2”项下方法在517 nm 波长处测定吸光度，计算清除率，结果见表2，可知6 h 内样品稳定性良好。

表2 酶标法稳定性试验结果

2.2 川芎、防风单用及合用对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

2.2.1 分组与给药 分别称取川芎90 g、防风90 g、川芎和防风各45 g，70%乙醇浸泡30 min 后回流提取2 次，提取液浓缩至0.4 g/mL。将60 只雄性SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、川芎组（4 g/kg）、防风组（4 g/kg）、川芎防风合用组（4 g/kg），每组12 只，再灌注同时灌胃给药，每天1 次，连续7 d，假手术组和模型组灌胃等量的生理盐水。

2.2.2 大鼠大脑中动脉栓塞模型（MCAO）的建立 将称重后的大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，Longa 线栓法［12]制备MCAO 模型。缺血1 h 后松开动脉夹行再灌注，若苏醒后的大鼠出现同侧Honor 症和对侧前肢提爪，则表示造模成功。

2.2.3 大鼠神经功能评分 参考Longa［12]5 分制评分标准，在大鼠再灌注第7 天观察并记录神经功能缺损症状，再进行评分。

2.2.4 大鼠脑梗死率计算 第8 天大鼠断头取脑，用生理盐水漂洗，吸干表面的水分并速冻20 min，作冠状切片，TTC 溶液38 ℃孵育10 min，利用Image J 软件计算脑梗死面积和全脑面积，计算出脑梗死面积百分比，脑梗死面积百分比=（梗死面积/全脑面积）×100%。

2.2.5 脑缺血氧化损伤相关指标检测 取大鼠缺血侧脑组织制备10%组织匀浆，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定脑组织SOD、MDA、LD、LDH水平。

2.3 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行分析，数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One way ANOVA），组间两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 川芎、防风单用及合用对DPPH 自由基清除率的影响如图1 所示，在8～26.8 mg/mL 范围内，川芎对DPPH自由基的清除率随川芎比例增加而逐渐增大，随后保持稳定；在13.2～32 mg/mL 范围内，防风对DPPH 自由基的清除率随防风比例增加而逐渐增大；川芎防风比例为1∶4、1∶3、1∶2、1∶1 时，对DPPH 清除率具有较好的协同作用，其中以1∶2、1∶1 时协同作用更为明显。

图1 各组DPPH 清除率（n=3）

3.2 各给药组对脑缺血大鼠神经功能和脑梗死面积百分比的影响 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分及脑梗死面积百分比增加；给药组可改善神经功能缺损症状，降低脑梗死面积百分比（P＜0.01）；合用组优于川芎组、防风组（P＜0.01）。见图2、表3。

表3 各组大鼠神经功能评分及脑梗死面积百分比（）

表3 各组大鼠神经功能评分及脑梗死面积百分比（）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与川芎组比较，△△P＜0.01；与防风组比较，☆☆P＜0.01。

图2 TTC 染色后各组脑切片

3.3 脑组织中脑缺血氧化应激指标

3.3.1 各组大鼠脑组织中SOD 水平 如图3 所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中SOD 水平降低（P ＜0.01）；与模型组比较，给药组SOD 水平升高（P＜0.01）；与防风组比较，合用组SOD 水平升高（P＜0.05）。

图3 各组大鼠脑组织中SOD 水平（n=9）

3.3.2 各组大鼠脑组织中MDA 水平 如图4 所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中MDA 水平升高（P ＜0.01）；与模型组比较，给药组MDA 水平降低（P＜0.01）；与防风组比较，合用组MDA 水平降低（P＜0.05）。

图4 各组大鼠脑组织中MDA 水平（n=9）

3.3.3 各组大鼠脑组织中LDH 水平 如图5 所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中LDH 水平升高（P ＜0.01）；与模型组比较，给药组LDH 水平降低（P＜0.01）；与防风组和川芎组比较，合用组LDH 水平降低（P ＜0.05）。

图5 各组大鼠脑组织中LDH 水平（n=9）

3.3.4 各组大鼠脑组织中LD 水平 如图6 所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中LD 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药组LD 水平降低（P＜0.01）；与川芎组和防风组比较，合用组LD 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图6 各组大鼠脑组织中LD 水平（n=9）

4 讨论

DPPH 是一种稳定的深紫色自由基，通过测定待测物质与DPPH 反应后颜色变浅程度来反映该物质清除自由基的能力和抗氧化能力［13]。川芎-防风比例为1∶2 和1∶1时，两者合用对DPPH 自由基的清除表现出较好的协同作用，表明川芎-防风在这两种配伍比例下具有较好的体外抗氧化协同作用，可为动物体内实验提供配伍比例依据。

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的级联反应过程，其发生机制由多种因素共同参与，如过多自由基生成、凋亡基因激活、炎症反应等一系列病理变化，各因素相互影响，最终导致细胞凋亡或坏死，出现脑神经功能缺损等症状［2]。脑缺血再灌注发生时，局部缺血引发了活性氧簇的大量产生［14]。SOD 为人体最重要的抗氧化酶之一，过多的氧自由基会消耗大量的SOD，使其活性降低。SOD 活性下降可导致脑内氧自由基大量堆积，进而攻击生物膜中不饱和脂肪酸，导致MDA（脂质过氧化产物）大量产生［15-17]，从而使机体氧化功能紊乱。LDH 是一种和葡萄糖代谢相关的酵素，广泛存在于身体器官组织中。脑缺血发生时，细胞膜因受到损伤而通透性增加，LDH 释放到膜外。由于氧供应被阻断，脑组织细胞只能通过无氧代谢获取能量，产生大量的代谢产物LD［18]。

脑缺血动物实验表明，川芎、防风及合用均可改善脑缺血大鼠神经功能的缺损症状、降低脑梗死率、提高脑组织中SOD 水平，降低MDA、LD 和LDH 水平，且川芎-防风合用在抗大鼠脑缺血再灌注损伤方面具有一定的协同效果，其机制可能与清除自由基发挥抗氧化作用有关。