姜黄素对糖尿病肾病小鼠肾脏自噬及氧化应激的影响

韩晓瑜，李嘉斌，丁杰英，温庆伟

（1.浙江大学医学院附属儿童医院，浙江 杭州 310000；2.广西医科大学，广西 南宁 530021）

糖尿病是人体代谢紊乱所造成的基础疾病且无法根治而伴随终身，因此长期高血糖会导致多种的并发症所发生［1]。糖尿病肾病是因为肾脏的高糖环境使大量的活性氧（ROS）产生而造成肾脏微血管氧化应激损伤的常见糖尿病并发症，其多出现于糖尿病后期病程上。对糖尿病肾病的治疗主要以药物调控血糖，同时联合血管紧张素转化酶抑制剂和钙拮抗剂药物进行治疗［2-3]。但从治疗效果看，存在着个体差异大、治疗效果不佳等情况，所积极探索防治糖尿病肾病的药物具有十分重要的现实意义。

姜黄素是从传统中药材姜科姜黄属植物姜黄（Curcuma longa L.）的根茎中提取的一种多酚类物质，具有良好的降血糖、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性，但是其对糖尿病肾病的机制尚不完全清楚［4-5]。本研究采用多次注射低剂量链脲佐菌素及摘除右肾法诱导建立糖尿病肾病小鼠模型，探讨姜黄素对糖尿病肾病小鼠肾脏自噬及氧化应激的影响，为其在糖尿病肾病的防治中提供科学的药理学依据。

1 材料

1.1 动物 昆明种小鼠，SPF 级，体质量18～22 g，购自广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（桂）2017-0005。实验开始前小鼠进行适应性喂养1 周。

1.2 药品与试剂 缬沙坦片，海南皇隆制药股份有限公司（批号190114）；姜黄素，瑞士Adamas 公司（纯度98%，批号190124B）；链脲佐菌素，美国Sigma 公司（批号S075）；线粒体呼吸链复合物I、III 试剂盒，上海杰美基因医药科技有限公司（批号S075）；羟自由基（-OH）、活性氧（ROS）试剂盒，南京建成生物工程研究所（批号20190817、20190825）；锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）ELISA 试剂盒，晶美生物工程有限公司（批号20190907、20190912、20190909）；尿蛋白（UP）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）试剂盒，上海荣盛生物技术有限公司（批号 20190814、20190811、20190820）；Beclin1、LC 3、磷酸 化-mTOR（p-mTOR）一抗，英国Abcam 公司（批号191017、191011、190927）。

1.3 仪器 血糖仪，瑞士罗氏公司ACCU-CHEK Performa；7060C 型全自动生化分析仪，日本日立公司；9602A 酶标仪，北京艾普生设备有限公司；垂直电泳仪、转膜及显影设备、凝胶电泳成像分析系统，美国Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 糖尿病肾病小鼠模型建立和给药 参考文献［6]，50 只空腹昆明小鼠行右肾摘除手术，另取10 只昆明小鼠为空白组行不摘除右肾的假手术。手术结束1 周后，向行摘除右肾的小鼠尾静脉注射40 mg/kg 链脲佐菌素（STZ），每天1 次，连续3 d。末次注射3 d 后，检测小鼠空腹血糖（FBG），将FBG ≥11.1 mmol/L 的小鼠随机分为模型组、缬沙坦组20 mg/kg、姜黄素高剂量组400 mg/kg、姜黄素低剂量组200 mg/kg，每组10 只，各组小鼠连续灌胃90 d，每日1 次；空白和模型对照组给予等量生理盐水。

2.2 肾脏组织形态学改变评分 根据文献［7]，随机取互不重叠的10 个视野，对肾小球系膜基质增生、空泡样变性、组织炎症细胞浸润3 项进行病变程度的半定量评分。计分为正常，0 分；轻度损害（病变范围＜30%），1 分；中度损害（病变范围30%～60%），2 分；重度损害（病变范围＞60%），3 分。

2.3 观察指标 末次给药后，收集小鼠尿液计算尿量，并检测24 h 尿蛋白（UP）含有量。血糖仪检查小鼠FBG，测定血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。HE 染色法观察糖尿病肾病小鼠肾脏的病理学变化。试剂盒检测法检测肾脏的羟自由基（-OH）、活性氧（ROS）水平及线粒体呼吸链复合物I、III（Complex I、III）的活性。ELISA 法检测肾脏锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性。Western blot 检测肾脏组织中线粒体自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC 3 的蛋白表达。

3 结果

3.1 姜黄素对DN 小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN水平的影响 与空白组相比，模型组小鼠24 h 尿量增加，UP 及血清Scr、BUN 水平升高（P＜0.01）；与模型组相比，缬沙坦组、姜黄素高、低剂量组小鼠的24 h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 水平减少（P＜0.05）；姜黄素高剂量组小鼠24 小时的尿量、UP 及血清Scr、BUN 含量低于姜黄素低剂量组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN 水平（，n=10）

表1 各组小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN 水平（，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 糖尿病肾病小鼠肾脏组织病理学 空白组小鼠肾小球饱满无空泡，无细胞坏死及炎性细胞浸润情况；模型组小鼠肾组织中存在大量的空泡，肾小球系膜基质增生，包曼氏囊腔皱缩且较多炎性细胞浸润；缬沙坦组组织空泡少见，包曼氏囊腔轮廓有所恢复，炎性细胞浸润减少（P＜0.01）；姜黄素高剂量组肾小球结构较完整饱满，包曼氏囊腔有少量空泡，包曼氏囊腔轮廓皱缩程度减少，少量炎性细胞浸润（P＜0.01）；姜黄素低剂量组曼氏囊腔空泡及炎性细胞浸润较多，但较模型组少（P＜0.05）。见图1、表2。

表2 各组小鼠肾脏组织形态学改变评分（，n=10）

表2 各组小鼠肾脏组织形态学改变评分（，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图1 各组小鼠肾脏病理变化（HE，×400）

3.3 姜黄素对糖尿病肾病小鼠肾脏中-OH、ROS 水平及Mn-SOD、CAT 水平的影响 与空白组比较，模型组小鼠肾脏中-OH、ROS 水平增加，Mn-SOD、CAT 的活性下降（P＜0.01）；与模型组相比，缬沙坦、姜黄素高、低剂量组小鼠的肾脏-OH、ROS 水平降低，Mn-SOD、CAT 水平增加（P＜0.05）；姜黄素高剂量组小鼠肾脏-OH、ROS 水平较姜黄素低剂量组低，Mn-SOD、CAT 的活性较姜黄素低剂量组高（P＜0.01）。见表3。

表3 各组糖尿病肾病小鼠肾脏中-OH、ROS、Mn-SOD、CAT 水平（，n=10）

表3 各组糖尿病肾病小鼠肾脏中-OH、ROS、Mn-SOD、CAT 水平（，n=10）

注：与模型组比较，**P＜0.01。

3.4 姜黄素对糖尿病肾病小鼠肾脏中Complex I、III 活性的影响 与空白组相比，模型组小鼠肾脏Complex I、III 活性降低（P＜0.01）；与模型组相比，缬沙坦、姜黄素高、低剂量组小鼠肾脏中Complex I、III 活性提高（P＜0.01）；姜黄素高剂量组小鼠肾脏Complex I、III 活性较姜黄素低剂量组高。见表4。

表4 各组糖尿病肾病小鼠肾脏中Complex I、III 活性（，n=10）

表4 各组糖尿病肾病小鼠肾脏中Complex I、III 活性（，n=10）

注：与模型组比较，**P＜0.01。

3.5 姜黄素对糖尿病肾病小鼠肾脏中线粒体自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 的蛋白表达影响 与空白组比较，模型组小鼠肾脏中p-mTOR 蛋白表达增加，Beclin1表达及LC3 II/LC3 I 比值减少（P＜0.01）；与模型组相比，缬沙坦、姜黄素高、低剂量组小鼠的肾脏中p-mTOR 蛋白减少，Beclin1 蛋白表达及LC 3 II/LC 3 I 比值增加（P＜0.01）。见表5、图2。

图2 各组糖尿病肾病小鼠肾脏中线粒体自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表达

表5 各组糖尿病肾病小鼠肾脏中线粒体自噬蛋白p-mTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表达（，n=10）

表5 各组糖尿病肾病小鼠肾脏中线粒体自噬蛋白p-mTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表达（，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 讨论

自噬为真核细胞的一种高度保守的进化过程，是细胞内的自身修复、物质再利用、抵抗氧化应激和慢性炎症反应等损伤的主要途径，对维持细胞的稳定起重要的作用［8]。自噬小体会包裹受损或老化的细胞质、细胞器、细胞内错误折叠蛋白质及大分子物质，通过溶酶体降解的方式，消除细胞毒性蛋白的聚集，使细胞内线粒体所产生的能力能被正常细胞所利用，维持细胞存活，而自噬异常则导致细胞功能障碍［9]。在肾组织中，自噬是肾小球滤过屏障的重要保护机制，正常情况下在肾脏的近端小管、足细胞都表现出高活跃度的自噬［10]。高糖的内环境下，会促进足细胞的自噬流，加速毛细血管扩张及肾小球硬化，诱导足细胞凋亡，致糖尿病肾病的发生发展。

肾脏内的高血糖内环境激活DAGPKC-NADPH 氧化酶信号通路，上调ROS 的生成，大量ROS 的堆积及机体抗氧化酶水平相对不足，使体内氧化/抗氧化作用失衡，进一步损伤线粒体呼吸链酶中Complex I、III 活性和线粒体内三羧酸循环，致线粒体功能障碍引起细胞凋亡［11]。提高机体的抗氧化酶Mn-SOD、CAT 的活性，增加对ROS、-OH 的清除能了，减少体内的氧化应激的损伤，使线粒体呼吸链复合物活性提高，恢复线粒体功能，对治疗糖尿病肾病有着重要的治疗意义。但单纯的提高机体的抗氧化酶的活性并不能很好的恢复肾脏细胞及线粒体的功能，因为被氧化应激损伤的线粒体、凋亡的细胞需要通过机体内的自噬降解，以提高线粒体及细胞的质量，增强细胞活力。因此在提高机体抗氧化能力的同时，还需增加机体对受损及坏死组织的自噬清除能力，才能更好的使线粒体所产生的能力能被正常细胞所利用，增强细胞的活力。

mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为自噬信号通路中一个十分关键的中心抑制剂［12]。mTOR 是缺乏氨基酸、生长因子、氧或ATP 等细胞应激源的自噬反应的汇集点，其通过负性调节的反馈机制，激活溶酶体重组多种因素诱导自噬的发生［13-14]。自噬效应蛋白Beclin1 和微管相关轻链蛋白LC 3 均是重要的自噬标记蛋白。自噬早期的囊泡由自噬效应蛋白Beclin1 与Ⅲ级PI3K 所结合形成的复合物［15]。正常情况下，LC 3 蛋白以LC 3 I 存在于细胞核内。当自噬启动时，LC 3 I 会被Atg 4 酶切转变成LC 3 II 的自噬体膜型，并与自噬体膜相结合［16]。故机体内LC 3 II 与LC 3 I 的比值及Beclin1 蛋白的表达水平会作为衡量自噬水平高低的评判指标。

本研究结果表明，姜黄素能改善糖尿病肾病下小鼠尿量、Scr、BUN、UP 的肾功能指标及其病理状态，同时能提高肾脏中CAT、Mn-SOD、Complex I、III 的活性及降低-OH、ROS 的含量。减少p-mTOR 蛋白表达，增加Beclin1蛋白表达及LC 3 II/LC 3 I 比值。提示，姜黄素对糖尿病肾病小鼠的作用机制为提高机体抗氧化能力的同时增加机体自噬活性，以达到对肾脏的治疗保护作用。