银杏内酯B 抗肿瘤活性研究进展

朱志斌冯自立 徐佳元陈 旺张宇航董梦尧

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；2.秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室，陕西 汉中 723001；3.陕西理工大学维生素D 生理与应用研究所，陕西 汉中 723001）

银杏内酯B 是从银杏叶中分离出的二萜类化合物，质量分数达1.2%以上，是目前有效活性内酯中活性最显著的成分［1]，具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、抗休克、清除自由基等多种药理活性［2-4]，具有保护脑缺血损伤、扩张冠脉血管、增强心肌收缩力、治疗老年痴呆等作用［5-9]，近年来研究发现它还可抗肿瘤［10]，逐渐受到国内外学者的关注。

银杏内酯B 对许多肿瘤细胞内、外都具有调节作用，通过NF-κB、MAPK、PI3K-AKT、ERK、mTOR 等途径抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。该成分被誉为天然的血小板活化因子受体（PAFR）拮抗剂，是治疗肿瘤细胞的关键调节因子，可与细胞受体和蛋白质结合，调控相关基因，改变细胞周期，抑制致癌物质及相关通路，阻止肿瘤细胞生长和转移，影响自噬来发挥抗肿瘤作用。

本文综述了银杏内酯B 的PAFR 构效关系，着重阐述该成分抗肿瘤活性及潜在作用机制，以期为进一步相关研究提供理论基础。

1 银杏内酯B PAFR 构效关系

银杏内酯B 分子由1 个螺壬烷（A 环与B 环）、1 个四氢呋喃环（D 环）、3 个内酯环（C 环、E 环与F 环）组成的刚性笼状十二碳骨架结构，侧链连接1 个叔丁基团，是一类稀有的天然化合物，构效关系见图1。银杏内酯B 独特的结构使其难溶于水，不易被生物体利用，发挥其应有药效，由此国内外学者对其C1-OH 位、C3-OH 位、C7-OH位、C10-OH 位、C 环、F 环及其他环系进行醚化、酯化、卤化、重氮化、氨基化、糖基化等，发现对C1、C10位引入大的芳香类基团、叔丁基基团时能得到活性更优的PAFR拮抗剂，其中引入吡啶环后衍生物拮抗性是银杏内酯B 的10.5 倍，同时C 环、D 环、F 环对活性也有很大影响，这些衍生物的合成改变了银杏内酯B 的结构，提高了该成分水溶性，有利于生物体吸收和发挥药效，并增加其拮抗PAFR 活性［11-12]。

图1 银杏内酯B PAFR 拮抗作用的构效关系

2 银杏内酯B 抗肿瘤机理

2.1 卵巢癌 卵巢癌是全球女性第五大癌症，也是妇科死亡率最高的疾病，分为I 型、Ⅱ型肿瘤［13]，前者发病模式包含 KRAS（V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog）、BRAF 等基因突变，以及罕见TP53（Tumor protein p53）突变、PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten）和 PIK3CA（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase，catalytic subunit alpha）信号通路异常、RAS 基因突变等。而后者发病机理包含TP53 突变、癌症基因CCNE1 扩增等［14-16]。

姜伟等［17]在体内外实验中发现，银杏内酯B 可抑制卵巢癌细胞的增殖和裸鼠瘤的增长，抑瘤率达到48%，与顺铂（CDDP）联合应用可达78.2%，可作为治疗卵巢癌的辅助药物，其机制可能是通过抑制血小板活化因子（PAF）、血小板活化因子受体（PAFR）表达来抑制酪氨酸激酶Src 和p38 丝裂原活蛋白激酶（p38MAPK），使p38MAPK 无法激活下游转录因子［18]，其中包括与细胞侵袭密切有关的环磷酸腺苷（cAMP）应答原件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），导致CREB 不能结合到基质金属蛋白酶 2/9（Matrix metalloproteinase 2/Matrix metalloproteinase 9，MMP2/MMP9）基因上游的启动子位置，MMP2、MMP9 mMRA 无法表达，从而抑制卵巢癌细胞迁移。除此之外，银杏内酯B 还上调了25 个具有抗肿瘤作用的蛋白（如p53），下调了22 个与肿瘤迁移有关的蛋白（如β-catenin）。

Jiang 等［19]发现，25～100 μmol/L 银杏内酯B 处理人卵巢癌细胞SKOV3、CAOV3 后，均能以剂量依赖的方式显著抑制细胞增殖（P＜0.05）；在100 μmol/L 银杏内酯B 处理卵巢癌细胞时，对卵巢癌细胞SKOV3 抑瘤率为57.3%，对卵巢癌细胞CAOV3 抑瘤率为63.1%；50 μmol/L 银杏内酯B 与1 μg/mLCDDP 联合应用时，卵巢癌SKOV3 细胞增殖下降到64.6%，卵巢癌CAOV3 细胞增殖下降到67.5%，细胞凋亡增加。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDSPAGE）分析总蛋白发现，p21 蛋白、p27 蛋白、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）升高，细胞周期蛋白（cyclin DI）降低。由此可知，银杏内酯B 可能通过上调p21、p27、caspase-3、caspase-8、下调cyclin DI 来抑制卵巢癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。

Yu 等［20]报道，PAFR 是一种新的有希望治疗肿瘤的靶点，顺铂（CDDP）治疗卵巢癌使NF-κB/p65 和缺氧诱导因子（HIF-1α）在细胞核内积累，导致PAFR 上调。银杏内酯B 抑制了PAFR，PI3K 和细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路，从而增强了卵巢癌细胞对CDDP 的敏感，通过PAFR 拮抗剂银杏内酯B、CDDP 共同治疗来显著降低肿瘤生长。

Ye 等［21]调查显示，长期使用银杏叶制剂后血浆中可检测到质量浓度高达8.5 ng/mL 的银杏内酯A、1.0 ng/mL的银杏内酯B，卵巢癌发生风险较未使用银杏叶制剂的女性有所降低。体外研究表明，含10、50、100 μmol/L 银杏内酯的标准银杏提取物对卵巢癌细胞OVCA429 具有显著抑制作用（P ＜0.01），50、100 μmol/L 银杏内酯A 及10、50、100 μmol/L 银杏内酯B 对人卵巢癌细胞OVCA429 增殖表现出极显著影响（P＜0.01），相比对照组降低了约60%，与标准银杏叶提取物的作用相当，在其他非黏液性卵巢癌细胞系（如OVCA420、OVCA433）中也观察到了类似的抗增殖作用，银杏内酯A、银杏内酯B 对卵巢癌细胞增殖的抑制率约为30%～40%。分析银杏内酯对浆液型卵巢癌细胞OVCA429 的细胞周期和DNA 分布的影响发现，银杏内酯B（100 μmol/L）处理OVCA429 细胞24 h 后，G0/G1期DNA 水平从47.9% 增加到51.5%，而S 期降至35.8%；100 μmol/L 银杏内酯B 处理OVCA429 细胞48 h 后，G0/G1期DNA 水平从47.9%增加到65.1%，而S 期降至24%；银杏内酯A 处理OVCA429 细胞48 h 后，G0/G1期DNA 水平从50.7% 显著增加到86.1%，而S 期从36.5% 减少到10.3%。由此推测，银杏内酯A、银杏内酯B 抑制卵巢癌细胞增殖可能与细胞周期中的G1至S 期阻滞有关。

2.2 乳腺癌 银杏内酯B 能高度抑制人乳腺癌的增殖［22]。Chan 等［23]发现，5～80 μmol/L 银杏内酯B 处理人乳腺癌MCF-7 细胞24 h 后，以剂量依赖性的方式对其增殖具有明显抑制作用。其机制可能是银杏内酯B 诱导乳腺癌细胞MCF-7 中活性氧的产生，使细胞质基质中游离的Ca2+、一氧化氮（NO）水平增加，线粒体膜电位（MMP）降低，caspase-9、caspase-3 蛋白表达激活，p53 基因、p21 基因mRNA 表达提高，从而促进乳腺癌细胞的凋亡。

Papadopoulos 等［24]体内外实验发现，银杏内酯B 通过控制外周型苯二氮卓受体（Peripheral benzodiazepine receptor，PBR）表达来控制肿瘤生长。在高度侵袭性、富含PBR 的人乳腺癌细胞系MDA-231 中，银杏内酯B 以时间和剂量依赖性方式降低PBR 表达和细胞增殖；在体内模型中，进一步验证了该成分显著抑制裸鼠体内MDA-231 细胞移植物的细胞核中PBR 表达和生长（P＜0.01）。

2.3 结直肠癌 结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是一种受染色体异常和基因突变的胃肠道恶性肿瘤，死亡率居高。杨彬等［25]用不同质量浓度（1、5、25 mg/mL）银杏内酯B 处理人CRC 细胞系HCT116 72 h，发现该成分以剂量依赖性的方式显著提高人CRC 细胞系HCT116 的增殖抑制率（P＜0.01）、细胞凋亡率（P＜0.01），前者在25 mg/mL下的细胞凋亡率为47.8%，与对照组相比有显著性差异（P＜0.01），其机理可能是降低抗凋亡蛋白Bcl-2 基因表达，升高促凋亡蛋白Bax 活性，抑制线粒体融合蛋白1（Mfn1）表达，从而促进结直肠癌细胞的凋亡及裸鼠瘤的增长。

Sun 等［26]报道，银杏内酯B 通过对PAF 的抑制作用可显著抑制结肠炎，并减少了氮氧甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的CAC 中的肿瘤数量和负荷，可能与银杏内酯上调血清血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）活性，降低肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、IL-6）表达，降低肿瘤细胞中血管内皮生长因子（VEGF）、微血管密度（MVD）表达有关，因此，PAFR 拮抗剂可能是新颖的CAC 治疗策略。

2.4 膀胱癌 膀胱癌始于膀胱移行上皮，会在膀胱外积聚并扩散到附近淋巴结或其它部位，这一侵袭特征揭示了其侵袭性调控的基本机制。锌指转录因子（ZEB1）基因的表达量与肿瘤的侵袭与转移有密切地关系，银杏内酯B 可剂量依赖性地降低膀胱癌细胞ZEB1 基因的表达，从而抑制膀胱癌细胞的侵袭。Zhi 等［27]用不同浓度（0.5、1、2 nmol/L）银杏内酯B 处理人膀胱癌细胞系24 h，发现该成分剂量依赖性地降低膀胱癌细胞中ZEB1 蛋白，但不降低mRNA 水平，在翻译水平上调节ZEB1，其机制可能是银杏内酯B 通过产生大量miR-223-3p 来与ZEB1 mRNA 的3′-UTR 结合，阻止翻译ZEB1 蛋白，降低膀胱癌细胞扩散，从而抑制膀胱癌细胞的增殖。

Kispert 等［28]发现，香烟烟雾提取物（CSE）暴露于膀胱癌细胞后可使PAF 积累，PAFR 过表达，促进细胞的跨内皮迁移，增加膀胱癌细胞与膀胱内皮细胞的粘附，促进膀胱癌细胞转移，而银杏内酯B 可以消除这种作用。因此，PAF-PAFR 相互作用的靶向性可以作为一个有益的治疗靶点，用于抑制膀胱癌细胞的侵袭。

2.5 肝癌 Chan 等［29]用不同浓度的的银杏内酯B 处理乙醇诱导的人肝癌细胞HepG2，发现低剂量（5～25 μmol/L）银杏内酯B 可抑制乙醇诱导肝癌细胞的凋亡，而高剂量（50～100 μmol/L）下以剂量依赖性方式增强了乙醇诱导肝癌细胞凋亡，其机制可能是高剂量银杏内酯B 通过增强活性氧（Reactive oxygen species，ROS）产生、激活氨基末端激酶（JNK）和caspase-3 信号、DNA 片段化去促进肝癌细胞凋亡。因此，银杏内酯B 具有抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡的能力。

Ghosh 等［30]用载有银杏内酯B 的聚合物纳米胶囊处理二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠肝癌，发现未涂层的GB聚合物纳米胶囊具有一定的预防肝癌细胞的能力，可能是纳米胶囊表面正电位使更高的GB 在肝细胞内蓄积，尤其是在电子致密的细胞器线粒体中积累。另外，银杏内酯B调控活性氧、p53、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21、NF-κB、诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶-2（COX-2）、VEGF 表达来保护线粒体免受二乙基亚硝胺引起的氧化损伤，从而预防肝癌细胞（Hepatocellular carcinoma，HCC），反映出抗癌潜力。

2.6 胰腺癌 胰腺癌是一种致死性极强的疾病，其特征是间质浓密，血管形成不足，很难被许多药物和免疫系统穿透，存活率极低。Lou 等［31]报道，500 μmol/L 以下银杏内酯B 对胰腺癌细胞无明显的细胞毒性，而与吉西他滨联用时可增强了细胞对后者的敏感性，抑制细胞的增殖，从而促进其凋亡，其机制可能是银杏内酯B 可抑制PAFR 表达，显著降低NF-κB/p65 磷酸化，抑制了NF-κB 活性，增加了胰腺癌细胞系BxPC-3、CAPAN1 对吉西他滨的敏感性，促进胰腺癌细胞凋亡。

2.7 前列腺癌 前列腺癌（prostate cancer，PCA）是导致癌症死亡的第二大主要原因，也是男性中最常见的癌症。Yao 等［32]指出，PAFR 可促进肿瘤发生、血管生成、转移，有望作为抑制前列腺癌的新靶标。用银杏内酯B 处理前列腺癌细胞PC3、LNCaP 后，可提高其对电离辐射的敏感性，增强杀伤作用，减轻肿瘤负担，其机制可能是该成分通过阻断PC3、LNCaP 细胞内PAFR/Beclin 1 复合物的形成来激活丝氨酸磷酸化功能，使放射后PAFR 表达增加，从而起到增敏作用。

Ji 等［33]研究表明，PAFR 能激活ERK 1/2 通路，进而增加MMP-3 的表达，降低钙粘附蛋白E（E-cadherin）的表达，最终促进前列腺癌细胞的生长、侵袭和转移。因此，PAFR 可能成为前列腺癌治疗的潜在靶点，为治疗前列腺癌提供新策略。

2.8 肺癌 非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的一大类，其风险和转移是由多种异常的分子改变引起的，包括KRAS、PI3K、Akt 或Raf 癌蛋白的突变激活及抑癌基因（PTEN 和TP53）的失活［34]。研究表明，PAFR 是G 蛋白偶联受体（GPCR）之一，PAR 激活PAF/PAFR 信号轴，启动PAFR 与信号转绿激活因子（STAT3）之间的前反馈回路，促进人非小细胞肺癌细胞恶性转移，可通过上调G 蛋白依赖的酪氨酸激酶Src 或JAK 2激酶的活性来增强白细胞介素-6（IL-6）表达，从而激活STAT3，刺激上皮间充质转化（EMT），驱动NSCLC 的恶性进程［35]。而且，特异性PAFR 拮抗剂可能是抑制NSCLC侵袭的新靶点。

Coyne 等［36]报道，50 μmol/L 银杏内酯B 对肺腺癌细胞（A549）的最大杀伤力仅为5.3%。而与地塞米松联合配伍后最大抑瘤率达到58.6%。

赵林等［37]发现，银杏注射液可有效缓解肺癌患者的血液高凝状态（P＜0.05），并且与其他临床药物相比不容易出现出血等不良反应。其中GB 作为PAFR 拮抗剂发挥了主要作用。

2.9 抗食管鳞状细胞癌 食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率较高，其致病机理尚不清晰。Chen等［38]研究显示，PAFR 作为一种G 蛋白偶联受体在ESCC细胞中表达量增加，促进体内外ESCC 的恶性发展，而PAFR 的耗竭则抑制了这些效应，其机制可能是PAFR 通过上调FAK（Focal Adhesion Kinase）激酶活性，激活PI3K/AKT（Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT）、AKT 触发核因子NF-κB 转录来激活PAFR 表达，PAFR 和AKT 之间的这种相互正向调节促进了ESCC 细胞侵袭性。因此，天然PAFR拮抗剂银杏内酯B 有望成为治疗食管鳞状细胞癌的靶向抑制剂。

2.10 黑色素瘤 黑色素瘤生长、血管生成、转移的进展受到炎症性肿瘤微环境的强烈促进，这是由于炎症细胞、基质细胞分泌大量细胞因子和趋化因子所致。PAF 及其PAFR 被证明是肿瘤细胞与内皮细胞粘附、血管生成、肿瘤生长和转移的重要调节因子，在转移性黑色素瘤细胞中它刺激环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，并激活转录因子1（ATF-1），导致基质金属蛋白酶2（MMP-2）和膜型1-MMP 的过度表达，促进黑色瘤细胞侵袭。同时，凝血酶通过其受体蛋白酶激活受体-1（Protease activated receptor-1，PAR-1）的活性来调节肿瘤细胞与血小板和内皮细胞的粘附，促进肿瘤血管生成及肿瘤生长和转移［39-40]，故PAFR 抑制剂有望成为抑制黑色瘤侵袭的特异抑制剂。银杏内酯B 被誉为高效PAFR 拮抗剂，但该成分治疗黑色瘤细胞的作用需作进一步研究。

2.11 胚囊细胞增殖 Hsuuw 等［41]报道，银杏内酯B 可通过激活JNK（c-Jun N-terminal kinase）、caspase-3、p21-活化蛋白激酶2（p21-activated protein kinase 2，PAK 2）来对小鼠胚胎干细胞和囊胚的增殖起到一定抑制作用，并能诱导小鼠胚胎干细胞凋亡。

3 总结与展望

银杏内酯B 具有较强的抗肿瘤活性，不仅能有效抑制肿瘤细胞增殖，抑制其侵袭，诱导其凋亡，还可有效提高化疗药物的有效性，降低耐药发生，增强放疗敏感性。多项研究发现，该成分能抑制卵巢癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞的生长和增殖，相关靶点和通路较丰富，其机制主要涵盖干扰细胞周期，诱导细胞凋亡，调控GPCR、COX-2、NF-κB，MAPK，PI3K-AKT、ERK、mTOR 等信号通路，影响活性氧、P53、Bcl-2、cyclin DI、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21，诱导型一氧化氮合酶和VEGF 表达等方面。越来越多的证据显示，PAFR 在多种肿瘤细胞转移中起着重要作用［42-46]，其过表达可诱导血管生长因子，激活PI3K/AKT、STAT3、mTOR、NF-κB 等相关通路，上调MMP2、MMP9 表达及Src、JAK2 激酶、FAK 激酶等活性，从而促进了卵巢癌、非小细胞癌、食管癌、肝癌、黑色瘤等肿瘤的恶性发展，对其拮抗作用，包括清除自由基、抗氧化作用可能是银杏内酯B 防治肿瘤的关键，但其具体作用机制还需要继续研究探索。

银杏内酯B 的经典功能是抗血小板聚集，被誉为天然的血小板活化因子受体拮抗剂，主要用于保护脑缺血损伤及神经系统的保护，广泛应用于治疗阿尔茨海默病、哮喘、帕金森综合症等，但对其非经典功能抗肿瘤作用鲜有报道。本文对近些年有关银杏内酯B 抗肿瘤作用的文献加以综述，希望有更多研究人员将目光转向该领域，深度研究该成分相关机制，从而扩大其临床应用范围。

截至2013 年5 月，国家食品药品监督管理总局（SFDA）已经批准了173 个银杏叶制剂的生产批文，国内相关生产厂家达到一百多家［47]。我国是全球最大的银杏制品生产国和消费国，已经有多种银杏叶制剂、银杏内酯提取物、银杏内酯B 注射液上市，已成为治疗心脑血管疾病的优选天然药物，并且银杏类药品、保健品已有40 多种，其安全性、有效性已得到广泛认可。临床上，银杏类药物大多为复方制剂，随着有效药用成分的明确，银杏内酯A、B、C 等单一有效成分新药或混合制剂成为近十年来相继开发的目标，我国自主研发的银杏内酯B 注射液在治疗脑缺血方面的作用已得到临床初步证明，有望成为相关药物的新选择。

随着研究的不断深入，近几年来也有许多关于银杏内酯制剂在糖尿病、肝脏疾病、肾病、肿瘤等近20 种疾病方面的报道［48-51]，在已鉴定的12 种天然内酯类化合物中，对抗肿瘤活性研究主要集中在银杏内酯B 单体，应从丰富内酯单体及多组分多靶点协同作用的角度作进一步研究。目前，对银杏内酯B 抗肿瘤作用的研究仅处于基础研究阶段，将该成分及其衍生物开发为抗肿瘤药物还需要开展大量的基础研究和应用研究，具有广阔的前景。