折线型水溶性共轭聚合物m-PPEASO3Na荧光检测铜离子

孙礼林, 李佳眉

(安徽师范大学 化学与材料科学学院，安徽 芜湖 241000)

引言

铜作为一种人体重要的微量元素，在人体生理过程中起着重要的作用，例如它是许多金属酶的辅助因子，在能量的产生、二氧化碳的运输和活化、信号的传导中都起着重要作用[1]。然而当铜离子的浓度超过细胞的需求就会对生物体有毒，诱导胃肠道和肝肾的系统疾病，以及神经退化病如Menkes病和Wilson病等[2-7]。另外，铜离子为重金属离子，其污染会引发严重的环境问题和卫生问题。因此，铜离子的检测对人类健康和生态系统具有重要意义。

到目前为止，已经发展了许多铜离子检测方法，包括原子吸收光谱法、电感耦合等离子质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法[8-10]、有机荧光染料探针法[11-12]和电化学分析法等[13-14]。

荧光共轭聚合物在化学和生物传感器中的应用是近几十年来人们深入探讨和研究的一个重要领域。荧光共轭聚合物具有“分子导线”的性质，电子和能量能够在聚合物的共轭主链上快速迁移，对环境中极微量的淬灭剂显示出更迅速的响应，表现出“淬灭放大”效应。与小分子传感器相比，具有更高的灵敏度等优点。

非水溶性共轭聚合物在水中溶解性差，将不利于生物环境中实样的检测。为了更有效地进行生物分子或离子的荧光检测，人们在非水溶性共轭聚合物的基础上通过在疏水性的主链上添加离子型官能团[15-16]合成了水溶性共轭聚合物，带有离子化侧链和带有特定选择性官能团的水溶性共轭聚合物更有利于传感应用，更加具有重要的研究价值。水溶性荧光共轭聚合物与中性聚合物分子相比，与目标离子结合的亲和力更强。例如，许多水溶性共轭聚合物的在传感应用中就利用了聚合物带电荷的侧链基团和分析目标物如金属阳离子、磷酸阴离子、蛋白质、多电解质及多核酸电荷之间的静电相互作用提高其分析检测的灵敏度。

目前报道的水溶性共轭聚合物大多数主链中的单体是在苯环的对位、噻吩的2,5位或芴的2,7位进行偶联聚合的，因而聚合物主链通常都是直线型的。这一类聚合物合成和应用已被充分研究，其聚集状态和构象变化对荧光性质的影响也被充分讨论。与之相比，非直线型主链结构的水溶性共轭聚合物合成和应用、构象变化和荧光性能相互关系的研究报道还较为欠缺。为了在荧光传感应用中适应多种检测对象，合成和制备具有多样结构的荧光传感材料也是十分必要的。

Tan等人在2004年报道了一种水溶性PPE类共轭聚电解质，其链节中的单体是在苯环的间位连接(meta-linked)聚合的，故而整个聚合物主链呈折线型结构。他们对该折线型聚合物的光学性质和构象变化进行了进一步研究[17]。目前报道的折线型共轭聚电解质从链节组成来看主要有聚苯撑乙炔撑(PPE)、聚苯撑乙烯撑(PPV)、聚芴(PF)等类型。这一类折线型聚合物存在着溶剂诱导的自组装行为，聚合物疏水性的主链在水溶液中避开水相发生分子内折叠形成螺旋形构象，而在甲醇、四氢呋喃等良溶剂中聚合物主链则伸展开来，从而转变成伸展的无规线团构象。这两种构象在水和良溶剂构成的混合溶剂中随溶剂组成的变化和溶液pH值的变化而相互转变，进而影响聚合物的紫外吸收和荧光发射等光学性质。主链螺旋形构象有效地减少了水溶液中聚合物疏水主链之间的链间聚集，并且表现出放大的荧光淬灭效应，荧光被淬灭的效率不同程度地高于无规线团构象的聚合物，可望进一步提高聚合物的荧光传感性能。折线型聚合物的螺旋构象能够通过静电结合作用和嵌插作用与一些客体分子相互作用(这一特点与DNA大致相同)，这可能导致其与生物分子之间的结合更为牢固，使其在生物分子传感检测中更为有利[17-19]。

折线型水溶性荧光共轭聚合物的合成及其在离子、无机及有机小分子、DNA等生物大分子的荧光传感检测上的应用已有了不少报道，但仍有许多空间(如进一步提升其荧光传感灵敏度与选择性等)有待科研工作者进一步研究和探索。最近我们在工作中制备了一种新的折线型水溶性荧光共轭聚合物m-PPEASO3Na(结构见图1)，该聚合物长波激发和近红外发射的特点能够有效地减少紫外光激发时生物体自体荧光和光散射的干扰。利用Cu2+对m-PPEASO3Na的荧光淬灭效应，建立了一种高灵敏度的近红外荧光检测Cu2+的方法。该方法被成功用于合成样品和实际样品铜的检测，并取得了较好的效果。

图1 聚合物m-PPEASO3Na的结构(A)及其水溶液中的螺旋构象和铜离子对其荧光的动态猝灭(B)Fig.1 Structure of m-PPEASO3Na(A)；the helix conformation of m-PPEASO3Na in aqueous solution and dynamic quenching of its fluorescence by copper ions(B)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：UV-3010紫外-可见分光光度计(日本Hitachi公司)；FS5全功能稳态荧光光谱仪(英国爱丁堡公司)；DUG-9360电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；SV-1200T超声波清洗机(上海声源超声波仪器设备有限公司)；FA2004电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；PHS-3C酸度计(上海伟业仪器厂)；荧光比色皿；紫外比色皿等。

试剂：聚合物m-PPEASO3Na参考文献方法设计合成[20]。测试中所用的Cu(NO3)2，NaCl，AgNO3，Hg2Cl2，CaCl2，MgSO4，K2CO3，Pb(NO3)2，AlCl3，FeSO4及其它常规化学试剂购于上海国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。所有化合物或聚合物水溶液均用二次水配制。

1.2 实验方法

聚合物m-PPEASO3Na溶于二次水配成浓度为0.5mM的工作溶液，荧光测定时在2mL带刻度的离心管中放入适当体积的m-PPEASO3Na溶液和100μL 50mM Tris-HCl缓冲溶液，并且依次加入不同量的金属离子溶液。混合物用二次水稀释至刻度，充分混匀。室温下放置6min后，在荧光仪上测定635nm处的荧光。所有荧光检测实验中，狭缝宽度为2nm，激发波长为520nm。

2 结果与讨论

2.1 铜离子对m-PPEASO3Na荧光的淬灭及其淬灭机制

实验中试验了一些常见的金属离子包括生理相关金属离子(Ag+，Al3+，Ca2+，Cu2+，K+，Ni2+，Pb2+，Na+，Fe2+，Pr2+，Cr3+，Hg+)对聚合物m-PPEASO3Na水溶液荧光强度的影响。分别移取120μL的聚合物溶液至2mL的刻度离心管中，然后再依次加入100μL 1.0mM的硝酸铜水溶液以及其它含相应金属离子的化合物的水溶液，最后用二次水定容至2mL，然后和空白试样一起在同样条件下测定其荧光强度。实验表明大多数金属离子对聚合物水溶液的荧光强度影响不大，只有铜离子和镍离子使聚合物的荧光强度显著下降，而铜离子对聚合物的荧光淬灭效率最大。

荧光测定所用的激发波长为520nm，m-PPEASO3Na水溶液的最大发射波长为635nm，当Cu2+加到m-PPEASO3Na水溶液中，其荧光发射波长几乎不变，荧光强度则随着铜离子的浓度增加而逐渐减弱。在优化条件下，荧光淬灭程度与铜离子在2.3～65μM浓度范围内呈线性关系，这构成了利用m-PPEASO3Na荧光传感测定Cu2+的基础。

在标准曲线线性范围内F0/F相对于铜离子的浓度作图所得图形符合Stern-Volmer方程。但无论是动态淬灭还是静态淬灭，F0/F与Cu2+浓度之间均存在着线性关系[21-22]。为了考察铜离子对聚合物荧光的淬灭机制，实验中分别测定了聚合物水溶液加入淬灭剂铜离子前后的紫外-可见吸收光谱(图2A)和荧光寿命(图2B)。

图2 (A)m-PPEASO3Na在铜离子缺乏和存在时的紫外-可见吸收光谱，(B)m-PPEASO3Na在铜离子缺乏和存在时的荧光衰减曲线(铜离子的浓度为50μM)

从图2A可以看出在50μM Cu2+存在下，m-PPEASO3Na水溶液(浓度：54μM)的紫外-可见吸收光谱中最大吸收峰位置和加入铜离子之前相比几乎不变，说明聚合物与Cu2+没有形成基态络合物。继而考察荧光发射最大处所测的聚合物荧光衰减情况，m-PPEASO3Na水溶液在加入Cu2+之前和之后，荧光寿命分别是1.992ns和1.399ns(图2B)，淬灭剂Cu2+的存在明显降低了聚合物的荧光寿命。再进行变温实验(室温20℃和50℃)，在较高的实验温度下Cu2+对聚合物水溶液的荧光淬灭效率明显较高。这些都说明Cu2+对聚合物荧光的淬灭过程是一个动态淬灭过程。

在水溶液中折线型水溶性共轭聚合物m-PPEASO3Na的主链呈螺旋形构象(图1B)[17,23-24]，主链上极性的磺酸基带负电荷，当聚合物的激发态分子与带正电荷的金属阳离子Cu2+相互碰撞时，两者相互碰撞和吸引的结果，Cu2+和激发态的聚合物负离子可能形成了某种激态复合物(exciplex)，这就阻止了电子沿螺旋形的共聚物主链的转移，或者诱导了电子向电子受体的快速光诱导电子转移。Cu2+具有缺电子的d轨道电子构型，再加上静电相互作用，可以充当阳离子电子受体，电子转移的结果使聚合物的激发态分子失去其激发能，从而导致了Cu2+对m-PPEASO3Na荧光的高效动态淬灭。

2.2 实验条件优化

2.2.1m-PPEASO3Na浓度优化 在2mL离心管中加入浓度为0.5mM的聚合物m-PPEASO3Na水溶液10μL然后用二次水定容至2mL，得到浓度为2.7μM的聚合物溶液。同样方法可分别得到浓度分别为5.4，10.8，18.9，21.6，27，37.8，45.9，48.6，54，81，91.8，102.6μM的聚合物水溶液。

按同样的顺序和用量在不同离心管中依次加入浓度为0.5mM的m-PPEASO3Na水溶液，再分别加入120μL Cu(NO3)2(浓度为1.0mM)溶液，然后再用二次水定容至2mL得到含60μM Cu2+的不同浓度的聚合物水溶液。

依次测定Cu2+缺乏(Fo)和存在(F)时，不同浓度的m-PPEASO3Na对荧光强度的影响(图3A)，结果显示当聚合物m-PPEASO3Na的浓度为81μM，铜离子的淬灭程度达到最佳，因而选用浓度为81μM的m-PPEASO3Na溶液，以达到较高的分析灵敏度。

2.2.2 溶液pH值优化 取7个2mL离心管，加入不同pH的Na2HPO4-KH2PO4和Tris-HCl缓冲溶液及300μL浓度为0.5mM的聚合物m-PPEASO3Na水溶液，定容至2mL。另取7个相同的离心管加入同量的不同pH的Na2HPO4-KH2PO4和Tris-HCl缓冲溶液及300μL聚合物m-PPEASO3Na溶液，混匀之后加入60μL Cu(NO3)2溶液(0.1mM)并定容至2mL。静置10分钟后进行荧光检测。

由聚合物荧光发射强度随pH的变化(图3B)可以看出，聚合物m-PPEASO3Na在没有加入铜离子时，荧光强度随着pH的增大(溶液由酸性到碱性)而增大，加入铜离子后，荧光被部分淬灭，随着pH的增大荧光强度也出现了慢慢增加的趋势。而在pH=7.60处加入铜离子后聚合物荧光淬灭的程度最大。因此检测铜离子时皆在Tris-HCl缓冲介质中进行，最佳pH值为7.60。

2.2.3 测定时间优化 取2个2mL离心刻度试管，分别加入300μL浓度为0.54mM的m-PPEASO3Na水溶液，其中一个管中加入130μL浓度为1.0mM的Cu(NO3)2溶液，再分别用pH=7.60的50mM Tris-HCl缓冲溶液定容至2mL，此时离心管中Cu2+的浓度为65μM，m-PPEASO3Na的浓度为81μM。分别测定荧光强度，实验表明当m-PPEASO3Na溶液在室温下加入Cu2+6分钟之后，荧光淬灭程度和荧光强度基本保持不变(图3C)，因而本实验选择加入铜离子6分钟之后进行荧光测定。

图3 在Cu2+缺乏(Fo)和存在(F)时，m-PPEASO3Na水溶液浓度对荧光强度的影响(60μM Cu2+)(A);pH对m-PPEASO3Na荧光强度的影响(3.0μM Cu2+)(B);m-PPEASO3Na的荧光强度随时间的变化(65μM Cu2+，81μM m-PPEASO3Na)(C)。

2.3 干扰实验

为了评估所提方法的选择性，实验中还试验了该方法对一些潜在干扰物质的耐受水平。用5.0μM铜离子和不同浓度的潜在干扰离子(K+、Na+浓度为500μM，其它离子浓度均为65μM)预先混合再进行试验，并与未加干扰离子的铜离子测试结果相对比。由图4可知，大多数潜在的干扰离子对铜离子的测定仅产生微小的影响(信号改变均小于5%)，这表明m-PPEASO3Na作为近红外探针可以用于实际样品中铜的检测。

图4 其它离子的干扰实验Fig.4 Interference from some potential interfering ions

2.4 聚合物m-PPEASO3Na荧光传感检测铜离子

在2mL带刻度的离心管中分别加入300μL 0.54mM聚合物m-PPEASO3Na的水溶液、100μL pH=7.60 Tris-HCl缓冲溶液、0.1mM的硝酸铜水溶液46μL，然后用二次水定容至2mL，得到铜离子浓度为2.3μM的聚合物铜离子溶液。同样方法还可以分别得到铜离子浓度分别为5,9,10,13.5,19,30,40,50,65μM的聚合物铜离子溶液。使其混匀，6分钟之后进行检测。

如图5A所示，随着铜离子的浓度增加，聚合物荧光强度逐渐下降，但是波长移动不明显。当铜离子的浓度范围在2.3～65μM时，Fo/F相对于铜离子的浓度作图符合线性关系(图5B)，相关线性方程为Fo/F=1.1852+0.0236[Cu2+](r=0.99051)，检测限为0.07μM。

图5 (A)不同浓度铜离子(0,2.3,5,9,10,13.5,19,30,40,50,65μM)存在下,81μM m-PPEASO3Na的荧光光谱图；(B)Stern-Volmer曲线。

我们将本实验方法和近年文献报道的一些铜离子检测荧光方法[21-22,25-29]进行了对比，从表1可以看出，我们的实验方法展现出良好的分析灵敏度和线性范围，此外还具有长波激发、近红外发射和低背景干扰的优点。

表1 本实验方法和其他一些检测铜离子荧光测定方法的分析参数对比

2.5 分析应用

为了评估m-PPEASO3Na作为近红外探针测定铜的实用性，我们在优化条件下根据标准程序进行了两种合成样品和两种实际样品的测定。合成样品1的组成如下：6.0μM K+，6.0μM Na+，6.0μM Ca2+，6.0μM Mg2+，6.0μM Al3+。合成样品2的组成如下：2.0μM K+，2.0μM Na+，2.0μM Zn2+，2.0μM Co2+，2.0μM Fe3+。实际样品自来水和无机废液来源于合成实验室。实验结果如表2所示，表明本方法的可行性和实用性都可以满足实际样品的检测。

表2 合成样品和实际样品中铜离子的检测

3 结论

利用Cu2+对折线型水溶性共轭聚合物m-PPEASO3Na增强的荧光淬灭效应建立了一种高灵敏度的近红外荧光检测Cu2+的方法，并用此方法检测了合成样品和实际样品中的铜离子。m-PPEASO3Na探针具有长波激发和近红外发射的特点，可望在生物样品检测中能够有效地减少紫外光激发时生物体自体荧光和光散射的干扰。