尿酸上调心脏成纤维细胞骨桥蛋白表达促使细胞增殖及胶原蛋白分泌

刘云青 胡丐锋 徐鸿轩 孟令丙 李金明 刘德平

血清尿酸水平升高可增加局部氧化应激、炎症、胰岛素抵抗和肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，进而促进结构改变[1]。同时，流行病学研究表明，血清尿酸水平升高与心血管疾病的发生发展密切相关，包括冠心病、心力衰竭和心房颤动等[2-4]。

心肌纤维化是由多种因素引起的胶原纤维过度沉积，胶原浓度和体积分数显著增加，心肌中胶原类型比例失调和排列紊乱[5]。成纤维细胞是分泌细胞外基质蛋白的主要细胞，在心脏损伤修复和心肌纤维化过程中具有显著作用[6]。常驻成纤维细胞的活化和增殖是肌成纤维细胞的重要来源[7-8]。最近研究表明，骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是心肌纤维化中肌成纤维细胞活化的一个关键分子，进而也成为心力衰竭发生发展的一个强有力的驱动因素[9-12]。并且OPN可经凝血酶切割，切割后的OPN促纤维化的效果显著增强[13-14]。

因此，本实验利用不同浓度尿酸刺激原代人心脏成纤维细胞，观察OPN的表达情况，并进一步探索成纤维细胞的增殖、凋亡和胶原分泌变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原代人心脏成纤维细胞购自美国Science Cell公司；胎牛血清购自Hyclone公司；DMEM培养基购自赛默飞公司；尿酸购自SIGMA公司；FastKing反转录试剂盒[FastKing RT Kit(With gDNase)]购自天根生化科技有限公司；TB Green®荧光染料试剂盒购自TAKARA生物科技有限公司；Trizol细胞裂解液、RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝有限公司；蛋白酶抑制剂、10%聚丙烯酰胺凝胶预混液、ECL化学发光试剂购自新赛美公司；PVDF膜购自碧云天公司；OPN、α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)、Coll-1兔抗人一抗、β-Tubulin鼠抗人一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自Proteintech公司；CellTiter-Glo细胞活力试剂盒购自Promega公司；Trans-well小室购自R&D公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自翱擎生物科技公司；碘化丙啶PI染色试剂盒购自凯基公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将原代人心脏成纤维细胞用加入双抗的含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37℃、5% CO2的湿化培养箱中培养，当细胞生长融合至80%～90%时用0.25%胰蛋白酶溶液消化后传代，继续培养。

1.2.2 尿酸刺激 分别配置不同尿酸浓度的培养基：0、5、10和15 mg/dl，将原代人心脏成纤维细胞置于上述培养基中48 h。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR) Trizol裂解液提取各组细胞总RNA，使用FastKing反转录试剂盒在20 μl的随机引物反应中反转录RNA(1 μg)，循环温度42℃(15 min)、90℃(3 min)。用于实时荧光qPCR的引物见表1。用TB Green®荧光染料试剂盒[TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)]配置10 μl PCR反应体系，于罗氏LightCycler480中进行PCR反应，反应循环95℃ 30 s，1个循环下进行预变性，按定量分析模式在95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环进行PCR扩增，按融解曲线分析模式在95℃ 5 s，60℃ 60 s，95℃ 1 s 1个循环进行融解曲线分析，50℃ 30 s 1个循环进行降温，得出各反应孔的CT值。采用2-ΔΔCT法计算OPN、α-SMA、Coll-1相对内参基因GAPDH的扩增倍数，首先根据罗氏LightCycler480软件所测得CT值，计算出OPN、α-SMA、Coll-1基因的ΔCT值，后以尿酸0 mg/dl组为基准，计算出ΔΔCT值，得出扩增倍数为2-ΔΔCT。

表1 荧光染料法(TB Green®)引物序列

1.2.4 Western blot实验 RIPA裂解提取各组细胞总蛋白，制备标准蛋白上样样品。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、洗膜、封闭、转膜、裁膜，进而分别用OPN、α-SMA、Coll-1羊抗兔一抗、β-Tubulin羊抗鼠一抗，4℃孵育过夜，孵育二抗2 h，最后采用ECL化学发光试剂盒进行显影，显影后的条带用Image J软件对蛋白条带做灰度分析。

1.2.5 CellTiter-Glo细胞生长活力检测 将尿酸处理后的细胞用胰酶消化后均匀接种于96孔细胞培养板，37℃正常培养16 h，取出培养板室温放置30 min，每孔加入100 μl CellTiter-Glo®试剂，在振动器上振荡2 min使细胞充分裂解，室温下孵育10 min以稳定发光信号，用多功能酶标仪检测发光值。

1.2.6 Trans-well小室细胞迁移实验 将Trans-well小室置于24孔板，加100 μl无血清培养基于小室，向小室中加入200 μl浓度为2.5×105/ml的无血清细胞悬液，向外室中加入750 μl含血清的培养基，37℃培养12～16 h，弃去小室内的培养基，PBS清洗两遍，用3.7%的甲醛室温固定细胞2 min，弃去甲醛后采用PBS清洗两遍，无水乙醇室温通透细胞20 min，去除乙醇用PBS清洗两遍，加入结晶紫室温避光染色15 min，用棉签蘸干小室底部内面，于显微镜下计算细胞迁移数量进行统计学分析。

1.2.7 CCK-8细胞增殖毒性检测 将心脏成纤维细胞培养后传代至96孔板，培养12 h促使细胞贴壁，后分别用尿酸5、10和15 mg/dl完全培养基刺激48 h，用新鲜培养基更换尿酸培养基后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，将培养板放在培养箱内孵育2.5 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.8 碘化丙啶PI染色细胞凋亡检测 将原代心脏成纤维细胞培养至第4代，将细胞传代至6孔板培养，待细胞生长融合至80%左右时，分别加入尿酸0、5、10和15 mg/dl完全培养基培养72 h。用胰酶消化并收集细胞，1×BufferA洗涤细胞一次(离心2 000 rpm，5 min)，加适量的1×BufferA重悬细胞，调整细胞浓度约为105/ml；取95 μl细胞悬液，加入5 μl PI染液，轻轻混匀；滴加于载玻片上，室温避光放置5 min后，加盖玻片；荧光显微镜绿光滤光镜观察。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 心脏成纤维细胞生长活力变化

各组细胞活力检测结果显示，尿酸5、10和15 mg/dl组的心脏成纤维细胞的细胞增殖活力较尿酸0 mg/dl组均有增加(均为P<0.05)，且表达趋势随尿酸浓度升高呈倒U型曲线关系，见图1。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl组(n=6)

对尿酸处理后的细胞进行传代培养12 h后发现，尿酸10和15 mg/dl组细胞贴壁融合生长面积明显比尿酸0和5 mg/dl组快(图2)。与尿酸10 mg/dl组相比，尿酸15 mg/dl组的细胞活力有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，考虑可能是尿酸浓度过大的情况下，细胞耐受能力减弱，进而活力降低。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl组；各组细胞经胰酶消化后传代至25 cm2培养瓶，培养24 h后拍摄，观察细胞生长融合程度，肉眼观察具有差异

2.2 心脏成纤维细胞增殖毒性改变

各组细胞增殖能力检测结果如图3所示，经CCK-8试剂孵育2.5 h后，尿酸5和10 mg/dl组吸光值较尿酸0 mg/dl组显著增加(均为P<0.05)，细胞增殖能力明显增强，各组间增殖趋势与细胞活力测试结果相符。然而与尿酸10 mg/dl组相比，尿酸15 mg/dl组的细胞增殖能力下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，考虑可能是尿酸浓度过大的情况下，细胞耐受能力减弱，进而增殖能力降低。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl组(n=10)

2.3 心脏成纤维细胞迁移能力变化

Trans-well小室检测结果如图4所示，与尿酸0 mg/dl组相比，尿酸5、10和15 mg/dl组的细胞迁移能力均增强，以尿酸10 mg/dl组增强最明显。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl组；图中染成紫色的细胞为穿过小孔的细胞，紫色细胞越多表明细胞迁移能力越强

2.4 心脏成纤维细胞中OPN、α-SMA和Coll-1 mRNA的表达变化

实时荧光qPCR结果显示，OPN、α-SMA mRNA的相对表达量随着尿酸刺激浓度的升高而增加，在尿酸浓度为10 mg/dl时达到最大值，在尿酸15 mg/dl组有所下降(P<0.05)；与尿酸0 mg/dl组相比，Coll-1 mRNA的相对表达量在尿酸 10 mg/dl组显著升高(P<0.001)，见图5。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl组；A：Coll-1 mRNA相对表达量(n=14)；B：OPN mRNA相对表达量(n=15)；C：α-SMA mRNA相对表达量(n=14)

2.5 心脏成纤维细胞中OPN、α-SMA和Coll-1 蛋白的表达变化

Western Blot结果显示，与尿酸0 mg/dl组相比，经尿酸刺激48 h后的其他3组细胞中OPN蛋白的表达均显著增加(均为P<0.001)，以尿酸10 mg/dl组最明显。α-SMA作为成纤维细胞活化的标志，其在尿酸10 mg/dl组中的表达明显增加(P<0.001)；Coll-1作为纤维化程度的标志，其在尿酸10 mg/dl组中表达也明显上调(P<0.001)。然而，尿酸5、15 mg/dl组的α-SMA和Coll-1蛋白表达倍数与尿酸0 mg/dl组无明显差异，可能由于尿酸15 mg/dl影响了成纤维细胞的活性，使α-SMA和Coll-1基因生成受到抑制(图6)。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl组；A：目的蛋白Coll-1、OPN、α-SMA及内参蛋白β-Tubulin电泳图；B：Coll-1 蛋白相对表达量(n=11)；C：OPN蛋白相对表达量(n=14)；D：α-SMA蛋白相对表达量(n=12)

2.6 心脏成纤维细胞凋亡的改变

碘化丙啶凋亡检测结果如图7所示，经尿酸刺激72 h后，与尿酸0 mg/dl组相比，尿酸5、10和15 mg/dl组的凋亡细胞数量均相对减少，以尿酸10 mg/dl组凋亡细胞最少。成纤维细胞凋亡减少，存活时间增加，分泌胶原的时间和量均增加。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl组；图中红色荧光细胞为PI染色阳性细胞，标志细胞凋亡

3 讨论

心肌纤维化是多种心血管疾病的共同最终病理状态[5]。OPN在健康心肌中表达较少，其表达是由各种损失刺激触发的，并与显著的间质和血管周围纤维形成有关，进而导致心力衰竭的发生[11-12]。

尿酸是通过饮食和内源性来源积累的嘌呤代谢而产生的最终产物[15]。一些动物实验表明，可溶性尿酸在心血管疾病的血管结构改变中起直接作用[16-17]。高尿酸血症的物理化学定义可用特异性尿酸酶法测定，尿酸盐在血浆中的溶解度超过一定水平容易导致晶体形成[18]。本实验结果中，OPN、α-SMA、Coll-1的表达均在尿酸10 mg/dl时最高，而当尿酸刺激浓度为15 mg/dl时上述基因的表达均有所下降。在多项细胞实验中所采用的尿酸刺激浓度有所不同，最高浓度为20 mg/dl，但多以10 mg/dl为上限[19-23]。Krça M的研究也得出与本实验类似的结果，即尿酸刺激对血管平滑肌细胞的影响呈剂量依赖性，但当尿酸浓度到达一定程度时刺激效果有所下降[19，24]。在一项尿酸刺激人脐静脉内皮细胞的实验中，发现内皮细胞的粘附能力、各种炎症因子的表达随着尿酸刺激浓度的增加而增加，当浓度为9 mg/dl时表达最高，当浓度为12 mg/dl时表达有所下降[22]。因此，实验结果出现尿酸刺激效果与尿酸浓度呈倒U型曲线并非偶然。一些研究表明，尿酸晶体能激活炎症反应、促进免疫调节、导致细胞死亡[25-26]。我们推测在本研究中出现类似结果的原因：当尿酸溶解到一定程度后饱和，尿酸晶体析出，晶体对细胞有一定的毒害作用，造成后期尿酸刺激的效果并未随着浓度的增加而一直增强。

本实验还表明，经过尿酸的刺激，成纤维细胞的细胞活力、活化及分泌胶原的能力均有所提高，OPN的表达也明显增加。有研究表明，OPN在促进成纤维细胞存活、活化、增殖、凋亡方面有重要作用[10]。OPN能促使心肌成纤维细胞衰老标志物的基因表达显著降低，而成纤维细胞活性和增殖能力明显增强[10]。OPN还能激活转录因子AP-1导致微小RNA-21转录激活并以PTEN/SMAD7为靶点，从而增加成纤维细胞的存活[27]。在心肌梗死所致的心肌纤维化中，OPN在促进肌成纤维细胞增殖、迁移和细胞外基质沉积及巨噬细胞增殖之间的细胞间信号传导中也发挥重要作用[28]。因此我们推测，尿酸能刺激成纤维细胞产生OPN，OPN进一步促使成纤维细胞活化、增殖从而导致胶原蛋白分泌增加，加速心肌纤维化进程。然而，本实验也存在一定的不足，即未进行动物实验验证OPN在心肌纤维化发生发展中的作用，因此在未来的研究中可利用OPN敲除或过表达小鼠验证其功能。

综上所述，尿酸能够刺激成纤维细胞表达OPN、促使细胞活化、增加胶原蛋白分泌、延缓细胞凋亡；并且刺激效果并非与尿酸浓度呈单纯的正相关，而作用效果随尿酸浓度呈倒U型曲线，在尿酸浓度为10 mg/dl时效果显著。

利益冲突：无