微小RNA-425-5p对心肌梗死诱导心肌纤维化影响

刘洪波 吴浩杰

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是一种常见的冠状动脉疾病，主要是由于冠状动脉栓塞导致心脏供血减少，心肌细胞缺氧坏死[1]。大量研究表明，MI后常引起心脏结构的病理性重构，心脏纤维化程度显著上升，大量胶原堆积，心室壁顺应性变差，并逐渐发展为心功能进行性障碍，最终导致心力衰竭[2-4]。目前，预防和逆转心肌重构已成为防治MI后并发症的难点之一，需关注MI后心肌纤维化发生机制。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类长度约为20～24个核苷酸的短链非编码RNA，在细胞内具有重要的调控作用，其功能主要涉及基因表达的转录后调控[5-7]。miR-425-5p是miRNAs家族成员之一，在哺乳动物中成熟的miR-425-5p具有高度的保守性。以往研究发现，miR-425-5p参与细胞增殖、凋亡和代谢等多种生理和病理进程的调控[8]，但有关探讨miR-425-5p在MI患者心肌纤维化进程中的相关机制的报道较少。基于此，本研究通过Target Scan网站预测发现转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是miR-425-5p的潜在调控靶点，采用冠状动脉左前降支结扎法构建大鼠MI模型及体外细胞模型，观察并探讨miR-425-5p的表达及其参与调控MI诱发性心肌纤维化的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及材料

洁净级健康SD雄性大鼠20只，体重180～200 g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。H9c2细胞系购自舜冉(上海)生物科技有限公司。

主要实验试剂包括：TRIzoL Reagent(Life technolagies，美国)；PAGE凝胶制备试剂盒(10%)(EpiZyme scientific，上海)；DMEM/HIGH GLUCOSE(HyClone，美国)；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche，瑞士)；PMSF(索莱宝，中国)；FETAL BOVINE SERUM(LONSERA，乌拉圭)；RIPA裂解液(Biosharp，中国)；TGF-β1(Abcam ab64715，英国)；高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5415R，德国)；PCR反转录扩增仪(BIO-RAD S1000，Thermal Cycler，美国)；Western Blot电泳仪(BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra System，美国)；凝胶成像仪(BIO-RAD ChemDoc XRS，美国)；超微量紫外分光光度仪(Thermo NANODROP ONE，美国)。

1.2 方法

1.2.1 构建MI大鼠模型 通过结扎SD大鼠冠状动脉前降支构建MI模型(n=10)。术前禁食水12 h，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，气管插管，连接至动物呼吸机上。于胸骨左缘第3、4肋间处，纵行切开皮肤，钝性分离肌肉，使用小动物开胸器撑开肋骨，暴露胸腔，使用眼科镊小心撕开心包膜，暴露心脏，观察心脏血管分布，寻找冠状动脉左前降支。在肺圆锥动脉与左心耳之间，距主动脉根部5 mm处，结扎冠状动脉左前降支，缝合胸腔。假手术组只进行穿线并不结扎(n=10)。全程监测大鼠心电图，心电图ST段抬高，结扎后心肌局部变苍白，肌钙蛋白检测呈阳性代表MI建模成功[4]。

1.2.2 检测心肌组织纤维化程度 取MI模型构建4周后的两组大鼠心脏组织适量，于4%的多聚甲醛中固定48 h，石蜡包埋，并常规切成3～5 μm切片，对切片进行Masson染色，中性树胶封片，置于显微镜下观察。胶原呈现蓝色，细胞核呈蓝黑色，肌纤维、红细胞、细胞质呈红色。

1.2.3 测定心肌组织胶原含量 将大鼠心肌组织适量制备组织匀浆，4℃以3 000 r/min离心10 min后取上清。按照试剂盒说明书操作流程设置好空白孔及标准品孔并依次进行操作，显色后利用酶标仪读取各孔吸光度，根据标准曲线计算出样本胶原含量。

1.2.4 检测心肌组织miR-425-5p及TGF-β1 mRNA表达 取适量大鼠心脏组织，采用常规方法提取心肌组织细胞的总RNA，并用超微量分光光度计测定RNA浓度及纯度。将提取的总RNA按反转录试剂盒说明书进行RNA反转录，合成cDNA。进行PCR实验。具体操作详见试剂盒说明书，采集荧光信号40个循环。以U6作为内参，目的基因miR-425-5p上游引物序列：CCAAGCAATGACACGATCACTC，下游引物序列：CAGTGCGTGTCGTGTCGTGGAG；U6上游引物序列：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物序列：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；以GAPDH作为内参，目的基因TGF-β1上游引物序列：GGCCAGATCCTGTCCAAGC，下游引物序列：GTGGGTTTCCACCATTAGCAC；GAPDH上游引物序列：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，下游引物序列：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。目的基因的相对表达水平用2-△△CT表示，每个样本独立重复3次。

1.2.5 检测心肌组织TGF-β1蛋白表达 取适量大鼠心脏组织，按照RIPA裂解液试剂盒说明书提取总蛋白。以30 μg的总蛋白进行电泳，随后采用湿法转膜，300 mA转膜90 min，待转膜结束后将NC膜放入含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中室温封闭2 h，与TGF-β1一抗(1∶1 000)稀释液共孵育，4℃冰箱摇床过夜。次日，收集一抗稀释液，TBST洗膜三次，每次10 min。随后于室温下与辣根过氧化物标记的IgG二抗稀释液共孵育2 h，TBST洗膜三次，ECL显影5 min，于凝胶成像仪分析蛋白条带。以GAPDH作为内参，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白IOD值/GAPDH内参蛋白IOD值，每个样本独立重复3次。

1.3 体外实验

1.3.1 H9c2细胞培养及分组 将H9c2细胞系置于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基内，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，根据细胞生长状态每隔2～3 d以1∶2的速度传代1次，取2～4代细胞进行后续实验。H9c2细胞转染按Lipofectamine 3000转染试剂盒说明书进行。分别以含miR-425-5p mimic和Negative Control miRNA mimic DMEM完全培养基转染H9c2细胞系，待转染24 h后将细胞分为对照组(NC组，不加任何物质处理)、模型组(CoCl2组，采用600 μmol/L氯化钴及无血清低糖培养液诱导H9c2细胞缺血缺氧模型)和miR-425-5p mimic处理组(CoCl2+miR-425-5p-mimic组，在模型组基础上加入含5×107TU/ml miR-425-5p mimic DMEM培养基)，每组设立6个复孔。

1.3.2 检测心肌细胞miR-425-5p及TGF-β1 mRNA表达 取各组H9c2细胞，Realtime-PCR法检测心肌细胞miR-425-5p和TGF-β1 mRNA表达及心肌细胞中胶原相关基因Col-1、Col-3及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的mRNA表达。

1.3.3 检测心肌组织TGF-β1蛋白表达 取各组心肌细胞，Western Blot检测心肌组织TGF-β1蛋白表达。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠MI模型

大鼠Ⅱ导联心电监测结果表明，各实验组缺血时均有ST段的显著抬高及下降，提示MI模型建立成功(图1)。

A：正常状态下肢Ⅱ导联心电图；B：缺血状态下肢Ⅱ导联心电图

2.2 两组心肌组织的纤维化程度及胶原含量

Masson染色结果显示，MI 4周后，假手术组的心肌细胞染色均匀，排列规则，细胞间隙有少量胶原填充，间隙匀称；MI模型组的心肌细胞排列紊乱，细胞间隙变大，间隙及血管周围大量胶原纤维堆积。心肌组织胶原含量测定结果显示，与假手术组比较，MI模型组胶原含量显著增加(0.68±0.09比0.34±0.08，t=0.153，P<0.01)，见图2。

A：对照组；B：MI组

2.3 两组心肌组织的miR-425-5p、TGF-β1 mRNA及蛋白表达

RT-PCR检测结果显示，与假手术组比较，MI组的心脏组织内miR-425-5p的表达水平显著下降(0.641±0.023比1.024±0.041，t=0.174，P<0.05)，而TGF-β1 mRNA水平显著增加(2.276±0.123比1.035±0.028，t=0.219，P<0.01)，且TGF-β1蛋白水平也显著增加(P<0.01)，见图3A。

2.4 各组H9c2细胞中miR-425-5p、TGF-β1 mRNA 及蛋白表达

与对照组H9c2细胞比较，CoCl2组细胞miR-425-5p表达显著降低(0.438±0.081比1.101±0.024，t=0.526，P<0.01)，而TGF-β1 mRNA水平及蛋白表达显著增加(2.674±0.556比1.022±0.033，t=0.631，P<0.01)。当转染miR-425-5p mimic使得H9c2细胞miR-425-5p过表达，降低了TGF-β1 mRNA的表达(1.401±0.095比2.972±0.16，t=0.330，P<0.01)，见图3B。

图3 各组心肌组织中TGF-β1的蛋白表达

2.5 各组H9c2细胞相关因子mRNA表达

RT-PCR检测结果显示，CoCl2处理的H9c2细胞中Col-1、Col-3、MMP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA表达均显著增加(均为P<0.01)。而经miR-425-5p mimic转染后，H9c2细胞中上述mRNA表达均显著降低(均为P<0.01)，故miR-425-5p可抑制CoCl2诱导的心肌纤维化，见表1。

表1 H9c2心肌细胞中Col-1、Col-3、MMP-1、MMP-2和MMP-9表达水平

3 讨论

MI后纤维化是导致心脏功能进行性障碍及心力衰竭的主要诱导因素[9]，故相关的机制研究对于心血管疾病预防及治疗至关重要。同既往研究结果相似[10-11]，本研究通过Masson染色及胶原含量测定观察MI大鼠的心肌组织纤维化程度，结果显示，在梗死心脏的心肌组织中，心肌细胞排列紊乱，大量胶原纤维堆积，提示MI后心脏纤维化程度严重。

miRNA与MI密切相关[12]。TGF-β1是转化生长因子超家族中的一员，参与多种器官纤维化的调控，通常在纤维化器官中显著高表达，是目前公认的诱导纤维化能力最强的生长因子[13]。本研究通过Target Scan数据库网站预测发现，miR-425-5p与TGF-β1 mRNA 3′ UTR区域有靶向结合位点(GUGUCAU)，并初步探索miRNA及TGF-β1在MI后心肌纤维化的发生及发展过程中的作用。Realtime PCR检测发现，与假手术组相比较，MI组心脏组织内miR-425-5p的表达水平显著下降(P<0.05)，TGF-β1 mRNA水平均显著增加(P<0.05)。MI组大鼠心脏中TGF-β1蛋白水平也显著增加，提示其miR-425-5p可能在MI后纤维化过程中对TGF-β1具有调控作用。多项研究表明，心肌细胞合成TGF-β1后可通过旁分泌作用于心肌成纤维细胞，诱导其向肌成纤维细胞转化[14-15]，促进其分泌胶原，进而导致胞外基质大量堆积诱发器官纤维化[16]。

我们进一步通过体外细胞实验来验证了miR-425-5p对TGF-β1的调控作用。采用H9c2细胞系为实验对象，利用CoCl2及无血清低糖培养液诱导H9c2细胞缺血缺氧模型模拟大鼠心肌缺血模型。Realtime PCR结果显示，与对照组H9c2细胞相比较，CoCl2组H9c2细胞中miR-425-5p表达显著降低，而TGF-β1 mRNA及蛋白表达均显著增加。当转染miR-425-5p mimic使得miR-425-5p过表达后，降低了因缺血缺氧诱导H9c2细胞引起的TGF-β1 mRNA表达的增加。为了验证miR-425-5p对心肌纤维化的调控作用，检测过表达miR-425-5p后，采用Realtime PCR检测各组H9c2细胞中胶原相关基因Col-1、Col-3及MMP-1、MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平。结果显示，与对照组相比较，CoCl2组H9c2细胞中上述因子mRNA表达显著增加。且经miR-425-5p mimic转染后，H9c2细胞上述因子 mRNA表达显著降低。这表明过表达的miR-425-5p可以抑制CoCl2诱导的H9c2细胞纤维化。

总之，miR-425-5p可通过抑制TGF-β1表达参与MI后纤维化的调控，但本研究样本量小，需要更多研究证实。

利益冲突：无