人参活性成分Rg3通过CASP8诱导胆管癌细胞凋亡作用研究——基于网络药理学筛选及实验验证

宋 爽 张 敏 吴可人

浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

胆管癌（cholangiocarcinoma）是一种起源于胆管上皮细胞且具有较高恶性程度的肿瘤[1]。手术是唯一能够治愈胆管癌的手段，但早期发现困难，只有约35%的患者能够早期发现并接受根治性手术，而晚期无法行手术治疗的患者，中位生存期仅为3～6个月[2]。基于化疗对胆管癌患者的重大意义，逆转MDR是对抗胆管癌的重要任务和提高患者生活质量的有效方式。人参（Panax ginsengC.A.Meyer）是五加科植物人参Panax ginseng C.A.Meyer的干燥根和根茎，属多年生草本植物，具有大补元气、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效。现代药理学研究发现，人参具有抗增殖、抗血管生成、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等特性[3]。人参对肝癌[4]、结肠癌[5]、皮肤癌[6]等多种肿瘤有明确作用。本研究基于网络药理学研究人参活性成分Rg3通过CASP8诱导胆囊癌细胞凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 收集疾病、药物靶基因：在GeneCards和Online Mendelian Inheritance in Man在线数据库输入“cholangiocarcinoma”，检索并收集胆管癌相关体内基因。本研究中涉及的生物物种均设计为“homo sapiens（human）”。借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSPp）挖掘“人参”的活性成分及靶标，后经UniProt查询对应靶标的基因名。

1.2 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建：在Venn在线工具中分别输入人参和胆管癌靶基因，可直接获取Venn图及两者交集基因。将交集基因导入STRING在线数据库，隐藏无连接的节点，即可得到PPI网络。

1.3 基因表达验证和生存分析：借助Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）数据库进行交集基因表达验证和生存分析。

1.4 通过CCK-8实验考察对Hucct-1细胞增殖作用：细胞培养：Hucct-1细胞（广州赛库生物有限公司）用含10%胎牛血清（美国Gibico公司）及1%P/N双抗（美国Gibico公司）的RPMI-1640培养基（美国HyClone公司）于 37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。以5×104/孔接种于96孔板。于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养12h后，分别加25、50、100μg/ml的Rg3（终浓度），设置空白对照组。分别作用24、48h后更换培养基，每孔加入10μl CCK-8（日本同仁化学研究所）溶液，孵箱继续培养1后测量450nm处的吸光度（OD）值。

1.5 Rg3诱导CASP8，Bax表达，抑制Bcl-2表达：细胞接种方法同上接种于6孔板每组3个复孔，Rg3干预细胞24h后，用细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。常规方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，脱脂牛奶封闭抗后敷育一抗、二抗（中国亲科生物有限公司），ECL法拍摄化学发光。检测灰度值。

1.6 统计学方法：应用 SPSS 23.0统计软件进行统计分析。所获数据以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，进一步比较行LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疾病-药物靶基因预测：本文借助两个数据库以尽量全面获取胆管癌相关体内基因，共1733个。TCMSP数据库包含了499味草药（中国药典2010版）以及每位草药的化合物成分（共计29000余个），本研究设置OB≥30%且DL≥0.18，共获得人参活性物质14个。

2.2 人参治疗胆管癌的可能靶点：经Venn工具共获得人参-胆管癌交集基因24个，此即为人参治疗胆管癌的可能靶点，详见表1和图1。

表1 人参活性成分调控体内基因与胆管癌靶基因交集基因名称

图1 胆管癌和人参交集基因

2.3 获取PPI网络：PPI网络如图2，图中节点代表基因，连线代表相互作用，不同颜色的线条代表不同的相互作用类型。

2.4 表达验证和生存分析：利用GEPIA-Boxplots对20个STRING筛选出的核心基因进行表达验证发现，与正常组织相比，在胆管癌样品中有8个基因（ALOX5、BCL2、CASP8、GSTP1、ICAM1、PLAU、PRKCA、PTGS1）高表达，3个基因（CYP1A1、NR1I3、PON1）低表达，详见图3。GEPIASurvival Analysis对表达有差异的11个基因的总体生存率（overall survival，OS）进行分析发现，ALOX5和CASP8的OS显著改变（P＜0.05），其余基因则没有显著性差异，结果见图4。

图3 胆管癌组织和正常组织中表达具有显著性变化的核心基因

图4 存活率显著改变基因的预后信息

2.5 Rg3对Hucct-1细胞增殖抑制作用：采用CCK-8实验考察给予Rg3作用24，48h对Hucct-1细胞增殖活性的影响。结果显示，25，50，100μg/ml的Rg3对Hucct-1细胞增殖具有明显作用，作用24h（P＜0.05）以及作用48h（P＜0.05）均有显著性差异（图5）。由结果可知Rg3 50，100μg/ml剂量组作用24h具有良好的剂量依赖性，因此后续实验以此为干预条件。

图5 不同浓度Rg3对胆管癌Hucct-1细胞增殖的影响

2.6 Rg3诱导CASP8、Bax表达，抑制Bcl-2表达：Rg3 50,100μg/ml作用Hucct-1细胞24h后，采用Western blot实验检测凋亡标签蛋白的变化。结果显示，与对照组相比，Rg3组CASP8（P＜0.01），Bax（P＜0.05）表达上调，Bcl-2表达下调（P＜0.05）。见图6。

3 讨论

本研究通过TCMSP共获得人参活性成分14个，通过GeneCards和OMIM获得胆管癌基因1733个，人参和胆管癌交集基因24个，STRING筛选出核心基因20个，表达验证证实，其中11个在胆管癌组织中的表达与正常组织相比发生了显著变化，而11个基因中，ALOX5和CASP8的OS显著改变。

花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）编码的人体5-脂氧合酶（5-LOX），相当文献表明5-LOX产物具有致癌潜力[7]，并认为5-LOX能为胆管癌治疗提供新的方法。凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶（caspases）对免疫细胞的存亡至关重要[8]，其中，CASP8与多种肿瘤发生发展密切相关。唐泓波等[9]研究发现，人参皂苷Rg3可以降低小鼠乳腺癌发生率、促进肿瘤细胞凋亡、提高小鼠CASP8表达量。虽然目前还没有人参作用于ALOX5/5-LOX、CASP8治疗胆管癌的直接证据，但网络药理学研究结果提示，人参的活性成分kaempferol和beta-sitosterol可以分别作用于ALOX5和CASP8，发挥治疗胆管癌的作用。

通过实验对筛选的CASP8进行验证，结果发现Rg3可通过上调CASP8诱导细胞凋亡，有效抑制Hucct-1增殖，进一步验证CASP8可能是Rg3诱导细胞凋亡，抑制胆管癌细胞增殖的靶点。

胆管癌病因病机未明、治疗过程中副作用多见且患者预后不佳，研发新的治疗靶点和药物刻不容缓。中药具有多靶点、多途径的作用特点，针对临床复杂疾病的治疗有其优势，已然成为抗肿瘤药物研发的热点。网络药理学、生物信息学等为中药在研发、疾病治疗方面提出了新方法。该方法基于整体，在各数据库中收集药物和疾病的信息，结合当前计算机技术，将成分多样的药物和因素复杂的疾病形成网络以分析，为系统筛选人参中具有治疗胆管癌成分及其可能的作用机制提供了思路，为后续研究奠定理论基础。