肾阳虚型类风湿关节炎骨质疏松模型建立与鉴定*

陆周翔 陶 松

浙江中医药大学附属湖州中医院 浙江 湖州 313000

本研究旨在构建肾阳虚类风湿关节炎(RA)骨质疏松（OP）的中医病证结合模型，探讨肾阳虚在RA-OP中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF级DBA/1(H-2q)小鼠，雄性，8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。在温度22±2oC，湿度50%～60%，光照12h光明和10h黑暗的环境明暗交替，换风次数15～20次/小时的环境下，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，实验饲养室许可证号SYXK（浙）2018-0012。

1.2 试剂与仪器：牛Ⅱ型胶原（Chondrex，批号：Chondrex 20022)，弗 氏 佐 剂（Chondrex，批 号 ：Chondrex 7001,Chondrex 7002)，小鼠白细胞介素17(IL-17)ELISA试剂盒（酶免，批号：MM-0170M1），小鼠骨保护素(OPG)ELISA试剂盒（酶免，批号：MM-0144M1），SYBR Green qPCR试剂盒（康为世纪，批号：CW2601），逆转录试剂盒（康为世纪，批号：CW2569），RIPA裂解液（碧云天，批号：P0013D），PMSF（碧云天，批号：ST506）。酶标仪（MD公司），核酸定量仪（Thermo Scientific），实时荧光定量PCR仪（罗氏公司）。

1.3 肾阳虚小鼠模型建立：取10只雄性DBA/1(H-2q)小鼠，皮下注射20mg·kg-1氢化可的松，每日1次，连续7d，进行小鼠肾阳虚造模；末次注射7d后进行类风湿关节炎的OP造模。

1.4 牛Ⅱ型胶原RA造模：取10只肾阳虚小鼠和10只正常小鼠进行RA造模，牛Ⅱ型胶原（sigma）以2.0mg/ml溶解在0.05mol/L醋酸（2.96ml乙酸用水稀释至1000ml）中，4℃过夜，逐滴加入等体积冷的完全弗氏佐剂（含有1mg/ml灭活的结核分枝杆菌）中后进行注射器乳化。第1天（第0周），每只小鼠接受0.1mg/0.1ml胶原，尾跟部2～3cm处皮内注射。免疫之后21天（第3周），动物接受完全相同的二次加强注射。造模成功后，RA-OP组（10只），肾阳虚型RA-OP组（10只）；另取10只正常DBA/1(H-2q)小鼠作正常组。

1.5 动物体重及足趾肿胀度：二次免疫后，持续8周，每周监测小鼠体重变化，测量足掌厚度获得肿胀程度。当小鼠开始出现明显红肿，疼痛及关节活动受限等典型的胶原诱导性关节炎（CIA）改变，记录时间，求得发生率。

1.6 生化指标检测：末次给药后，小鼠禁食12h，眼眶取血，离心机以3000rpm/min，离心15min，收集上层血清，-20℃保存，48h内采用全自动生化分析仪测定ACTH、CORT、CRH的含量。

1.7 ELISA检测血清中IL-17、OPG：末次给药后，小鼠禁食12h，作腹主动脉采血，离心机以3000rpm/min，离心15min，收集血清。ELISA法检测血清中IL-17、OPG的含量。

1.8 组织学观察：骨小梁可直接反应骨的强度和稳定性，12周后将股骨标本经固定，脱钙，脱水，石蜡包埋，5μm连续切片后HE染色，在光镜下观察其骨小梁的结构变化。

1.9 RT-PCR检测股骨头组织 Th17、OPG、RANK、RANKL mRNA表达水平：以Trizol溶液按常规方法抽提股骨头组织中的总RNA，按照试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA。以实时荧光定量PCR技术检测Th17、OPG、RANK、RANKL mRNA表达水平情况，运用2-△△Ct法计算基因相对表达量。所用引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列

1.10 统计学处理：采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料多组间用One-way-ANOAY单因素方差分析，组间比较采用SNK分析。方差不齐者采用Kruskal-Wallis H检验。所有数据以均值±标准差（±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾阳虚型RA-OP小鼠体重、足趾肿胀度、炎症评分：由表2可知，与正常组相比，RA-OP组与肾阳虚型RAOP组小鼠体重显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）。由图1可知，与正常组相比，RA-OP组与肾阳虚型RA-OP组小鼠足趾厚度与炎症评分显著上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 肾阳虚型RA-OP小鼠足趾肿胀度（±s，分，n=10）

表2 肾阳虚型RA-OP小鼠体重（±s,g,n=10）

表2 肾阳虚型RA-OP小鼠体重（±s,g,n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别1周2周3周4周5周6周7周8周肾阳虚型RA-OP组26.40±1.73 25.86±2.03 25.87±1.80 25.65±1.86 25.37±1.68*25.19±1.86**24.86±1.81**24.43±1.56**正常组25.31±1.89 25.81±1.76 25.96±1.91 26.73±1.71 27.25±1.87 27.34±1.60 27.92±1.80 28.14±2.12 RA-OP组26.76±1.59 26.45±1.42 26.05±1.39 25.48±1.48 25.26±1.67*24.75±1.47**24.48±1.36**24.31±1.47**

2.2 肾阳虚型RA-OP小鼠CIA发生率：由图2可知，正常组小鼠CIA发生率始终为0，RA-OP组小鼠在二次免疫后第45天CIA发生率为100%，肾阳虚型RA-OP组小鼠在二次免疫后第36天CIA发生率为100%。

图2 肾阳虚型RA-OP小鼠CIA发生率

2.3 HE染色：由图3可得，正常组小鼠骨小梁完整排列紧密；而RA-OP组与肾阳虚型RA-OP组小鼠骨小梁排列稀疏，变细，间距加宽，可见微骨折。

图3 小鼠股骨组织恢复的情况（HE染色，200×）

2.4 肾阳虚型RA-OP小鼠血清ACTH、CORT、CRH水平：由图4可知，与正常组相比，RA-OP组与肾阳虚型RA-OP组小鼠外周血 ACTH、CORT、CRH含量均显著下降（P＜0.01）。

图4 肾阳虚型RA-OP小鼠血清ACTH、CORT、CRH水平（±s,n=10）

2.5 肾阳虚型RA-OP小鼠血清IL-17与OPG水平：由表3可知，与正常组相比，RA-OP组与肾阳虚型RA-OP组小鼠血清，IL-17水平均显著上升，OPG水平均显著下降（P＜0.01）。

表3 肾阳虚型RA-OP小鼠IL-17与OPG水平（±s,n=10）

表3 肾阳虚型RA-OP小鼠IL-17与OPG水平（±s,n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01。

组别正常组RA-OP组肾阳虚型RA-OP组OPG(pg/ml)57.69±6.01 40.47±3.75**27.82±3.14**IL-17(pg/ml)117.69±13.79 160.13±19.64**187.05±17.52**

2.6 肾阳虚型RA-OP小鼠股骨头组织Th17、RANK、RANKL与OPG的mRNA表达水平：由图5可知，与正常组相比，RA-OP组与肾阳虚型RA-OP组小鼠股骨头组织Th17、RANK与RANKL mRNA水平均显著上升（P＜0.05），OPG mRNA水平显著下降（P＜0.01）。

图5 肾阳虚型RA-OP小鼠股骨头组织Th17、RANK、RANKL与OPG的mRNA表达水平（±s,n=3）

3 讨论

RA患者下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能会降低，自身免疫应答异常增强[1]。肾阳虚证的表现主要与HPA轴不同层次的功能紊乱有关[2]。IL-17和RANKL/RANK/OPG信号通路与RA的关系密切相关。IL-17可以通过对RANKL/RANK/OPG信号通路的调节对成骨细胞和破骨细胞的活化产生重要影响。研究表明，IL-17诱导RANKL表达的受体激活剂，对破骨细胞生成以及骨吸收有至关重要的作用[3]。动物实验证实，在胶原或佐剂诱导的关节炎的动物模型中，血清RANKL水平明显升高，且OPG水平降低，RANKL/OPG比值显著增加[4]。因此，RANKL/OPG比值的升高，在类风湿性关节炎患者的关节破坏和骨侵蚀中起着重要作用。

本研究采用氢化可的松联合牛Ⅱ型胶原建立肾阳虚型RA-OP中医病证结合小鼠模型，结果显示，小鼠出现畏寒喜暖，毛发干枯，蜷缩弓背等表现，肾阳虚型RAOP组小鼠体重显著下降，小鼠足趾厚度显著上升；肾阳虚型RA-OP组小鼠在二次免疫后第36天CIA发生率为100%。肾阳虚型RA-OP组小鼠骨小梁排列稀疏，变细，间距加宽，可见微骨折。肾阳虚型RA-OP组小鼠外周血ACTH、CORT、CRH含量均显著下降；IL-17水平均显著上升，OPG水平均显著下降；股骨头组织Th17、RANK与RANKL mRNA水平均显著上升，OPG mRNA水平显著下降。

此病证结合动物模型，是在中医学理论指导下，结合现代医学理论，同时采用传统中医学及现代医学病因复制证候动物模型，同时具有疾病与证候特征，具有较好的可靠性及稳定性。故本实验肾阳虚与类风湿性关节炎模型复合以复制肾阳虚型RA骨质疏松中医病证结合模型，更符合中医临床要求的动物模型。