以黄水为培养基生产细菌纤维素

文 章，何朝玖，陈 才，钱芪云，王桥慧，刘绪兴，杨生智，程 鹏，陈 杰,

(1.宜宾六尺巷酒业有限公司，四川宜宾 644000；2.劲牌有限公司，湖北黄石 435000)

细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是由微生物合成的由D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键聚合而成的多孔网状纳米级生物高分子聚合物[1]，其机械稳定性、热稳定性、高结晶度、高纯度(无木质素、半纤维素和果胶等杂质)、低密度、高比表面积、良好的透气性、高孔隙度、高含水量、保水能力高和良好的生物相容性等独特优良性质，使其在食品、造纸、纺织、生物医用材料、光学电子材料等方面都有着广泛应用[2-3]。BC的生物合成是一个受到多种微生物酶协同调控的复杂代谢过程[4]。糖类和醇类物质是BC生物合成最常用的碳源，葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)是被用于研究生物合成BC最多的菌种之一，其合成BC的主要途径见图1[5]。在不同碳源和生长因子(酵母提取物和蛋白胨)的合成介质中生产BC，成本昂贵，且BC产量低，同时对底物的利用率也不高，这些因素非常不利于BC的工业化大生产和应用。因此，寻找适宜的、价格低廉的原料来降低BC的生产成本是目前研究的重点和热点。

图1 木醋杆菌合成纤维素的主要途径Fig.1 The principal pathway of cellulose synthesis in Gluconacebacter xylinum

近年来，国内外先后报道了许多利用廉价原料生产细菌纤维素的研究。这些原料大多数都是工业和农业副产物，如烟草废料提取[6]、甜菜糖蜜和奶酪乳清介质[7]、酒厂废水[8]、玉米浆[9]、果汁[10]、玉米秸秆[11]、荔枝提取物[12]、饮料工业废物[13]、玉米芯酸水解液[14]、酒糟浸出液[15]、酒糟酶解液[16]、废啤酒酵母[17]和葡萄酒废料[18]等。黄水是在中国白酒的酿造过程中粮糟经各类微生物进行复杂分解代谢后产生的含有大量有机酸、可溶性淀粉、酵母溶出物、还原糖、酒精及香味物质的棕褐色的液体[19]。已有的研究表明，黄水中含有的葡萄糖等糖类，乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸，乙醇、丙三醇等醇类均有利于BC生产[7,20-21]。本实验为探究葡糖醋杆菌利用黄水生物合成BC的可行性，将黄水按照不同稀释比稀释后作为培养基，再将葡糖醋杆菌接种培养基中30 ℃静置培养14 d，发酵结束后测定BC产量、BC产率、BC日均产量、还原糖消耗率、总酸含量、pH值等指标，从而得到最佳的黄水稀释比，在此基础上再进一步探究黄水最佳稀释比下发酵过程中BC产量以及理化指标的变化趋势，以及不同灭菌方式对BC产量及各项理化指标的影响，从而为葡糖醋杆菌利用黄水发酵生产BC奠定理论研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)NZ9 六尺巷酒业有限公司筛选并保藏；新鲜黄水 六尺巷酒业有限公司酿造一车间；对羟基苯苯甲酰肼 东京化成工业株式会社；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、无水柠檬酸、十二水磷酸氢二钠、琼脂、氢氧化钠、盐酸(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；HS培养基 葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，无水柠檬酸1.13 g/L，Na2HPO45.0 g/L，pH 6.0，115 ℃灭菌20 min[22]。

PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司；离心机 上海安亭科学仪器厂；电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；恒温恒湿培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；722型可见分光光度计 上海佑科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄水理化性质测定 从酿造车间黄水坑中取新鲜黄水10 L，于4 ℃冰箱贮存备用。测定黄水总酸含量、pH、还原糖含量、乙醇含量。

总酸含量(以乙酸计)的测定参考GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》中的方法(下同)；pH的测定参考GB 5009. 237-2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》中的方法(下同)；还原糖含量的测定[23]：采用对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)试剂法(下同)；乙醇含量的测定参考GB 5009.225-2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的方法。

1.2.2 不同黄水稀释比例对BC产量及发酵液理化性质的影响 将黄水直接采用蒸馏水进行稀释，稀释比例依次为(黄水∶水，体积比0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，调节pH为6.0，将50 mL培养基分装于250 mL锥形瓶中，115 ℃灭菌20 min。以HS培养基为对照组，按照10%的接种量将经过3次传代培养的葡糖醋杆菌NZ19分别接种于以上培养基中，轻轻振荡，置于30 ℃培养箱中静置培养14 d，发酵结束后测定发酵液的总酸含量、pH、还原糖消耗量、还原糖消耗率、BC产量、BC平均日产量、BC产率。

1.2.2.1 还原糖消耗量及消耗率 计算公式如下：

1.2.2.2 BC产量的测定 参考文献[21]，将发酵液中生成的BC膜用纯水冲洗浸泡多次，至颜色较淡，再将BC膜置于80 ℃氢氧化钠(1 mol/L)溶液中浸泡90 min，然后再置于80 ℃蒸馏水中洗涤至中性，置于烘箱中75 ℃烘干至恒质量，称其质量。BC产量、平均日产量及产率计算公式如下：

1.2.3 发酵过程中BC产量以及理化指标的变化 选择1.2.2中BC产量最高时的黄水稀释比例，配制培养基，将50 mL培养基分装于250 mL锥形瓶中。按照10%的接种量将葡糖醋杆菌NZ19接种到培养基中，以HS培养基作对照，轻轻振荡，置于30 ℃培养箱中静置培养14 d，发酵结束后测定发酵液的总酸含量、pH、剩余还原糖含量、还原糖消耗率、BC产率及BC产量。

这样一来，中粮改变了传统的粮食贸易中间商角色，发挥起了龙头企业市场优势、物流优势、规模优势，把农业生产和物流、加工环节对接起来，成为农业生态圈的有机组织者，链接起小农户和大市场。形象地说，这就是打通线上线下全产业链的“粮圈儿”。2017年，中粮“粮食银行+”体系涉地面积40万公顷，惠及约41万户农民，带动农民增收5949万元。

1.2.4 不同过滤除菌方法对BC产量及理化指标的影响 将配制好的培养基用0.22 μm滤头在无菌条件下过滤至已灭菌的锥形瓶中，然后将50 mL无菌培养基分装于250 mL无菌锥形瓶中。按照10%的接种量将葡糖醋杆菌NZ19接种到培养基中，以HS培养基作对照，轻轻振荡，置于30 ℃培养箱中静置培养14 d，发酵结束后测定发酵液的总酸含量、pH、BC产率及BC产量。

1.3 数据处理

实验中每个处理重复三次，数据采用SPSS 22.0进行显著性分析，实验结果表示为平均数±标准差，图表分析由Excel 2010完成。

2 结果与分析

2.1 黄水成分分析

将从酿造车间取回的新鲜黄水于4 ℃冰箱静置过夜，待黄水清澈后取上层黄水检测总酸含量、pH、还原糖含量、乙醇含量，检测结果见表1。

从表1可知，新鲜黄水中含有还原糖12.43 g/L、总酸5.85 g/L以及乙醇3.61%。由此可知黄水中含有丰富的营养成分。王传荣[24]指出黄水中含有较多可发酵性糖，以及发酵降解和酵母细胞自溶而得来的蛋白质和氨基酸等，这些碳水化合物和含氮化合物是微生物良好的营养物质。在传统BC发酵培养基HS培养基中，合成细菌纤维素的前体物质主要来源于葡萄糖，营养物质则来源于蛋白胨、酵母浸粉等。因此，黄水中可供葡糖醋杆菌生长和BC合成的营养物质基本可以与HS培养基基本相当。马霞等[25-26]研究表明混合糖和有机酸(乙酸、柠檬酸)能够提高BC产量。张丽平等[27]研究结果表明乙醇、有机酸等多种混合碳源有利于菌株发酵合成BC。李周等[21]研究表明利用黄水-HS培养基静态发酵生产BC是可行的。因此，白酒酿造副产物黄水具有生产高附加值产品BC的潜在价值。

表1 黄水的理化指标检测结果Table 1 Detection results of physicochemical indexes of“yellow water”

2.2 不同黄水稀释比例对BC产量及发酵液理化性质的影响

为探究不同黄水稀释比对BC产量及发酵液理化性质的影响，直接将经过夜低温静置处理的上层黄水按照不同稀释比例用纯水进行稀释，调节pH 6.0经灭菌后作为BC静置发酵培养基(未添加任何外源营养物质)。不同黄水稀释比对BC产量及发酵液中还原糖消耗率的影响情况如图2所示。

图2 黄水体积比对细菌纤维素产量和还原糖消耗率的影响Fig.2 Effect of dilution ratio of "yellow water" on bacterial cellulose yield and reducing sugar consumption ratio

随着黄水稀释比的减小，BC产量呈现先增加后降低的趋势。当以纯水为培养基时，其仍有BC合成(0.26 g/L)，合成BC的营养物质完全来自接种培养基，这表明葡糖醋杆菌可以利用较低浓度葡萄糖合成BC。其当黄水稀释比为2∶8时，BC产量达到最高值(2.42 g/L)，比对照组的HS培养基BC产量(1.58 g/L)提高了53.2%。这表明黄水稀释比为2∶8时最适合BC的合成，此时培养基中的营养物质达到最佳比例。由于黄水中含有丰富的碳源和碳源，其中还原糖、乙酸、乳酸等均能提高BC产量[21]。同时由于黄水中还含有大量的可溶性淀粉，其能适当增加发酵液的黏度，防止菌体与细菌纤维素之间的交联凝聚，从而使得BC的产量提高[28]。当黄水稀释比超过2∶8后，随着稀释比例的下降，BC产量逐渐下降；当黄水未经稀释时，培养基中几乎不产生BC，且稀释比越低，BC产量下降越明显。这表明黄水中虽然含有葡萄糖、乳酸等有利于葡糖醋杆菌合成BC的物质，但同样也含有其他对葡糖醋杆菌生长和抑制BC合成的抑制剂(如糠醛、单宁等)[21,29-30]，当黄水稀释比例越低，有毒物质的含量越高，对葡糖醋杆菌的毒害作用越大；同时黄水稀释比例越低，其含有的酸类物质浓度越多，调节pH时消耗的NaOH量就越多，导致培养基集中Na+浓度越高，高离子强度也会抑制葡糖醋杆菌的生长和BC的生物合成[31]。以上这些因素都可能是当黄水稀释比过低时制约BC合成的原因。随着黄水稀释比例的下降，还原糖消耗率逐渐下降，且都显著低于对照组(78.53%)。当黄水稀释比在1∶9～3∶7时，还原糖消耗量均维持在66%左右。在黄水稀释比例为0时(未稀释)，此时培养基中虽然没有BC的生成，但是仍有少量(2.21%)的还原糖被消耗，可能是因为接种后葡糖醋杆菌虽然受到培养基中高抑制剂和高盐浓度的抑制而没有合成BC，但菌体仍进行了缓慢的生长繁殖，从而消耗了少量的还原糖。以上结果表明，将黄水进行合适的稀释后，相对于传统HS培养基能够明显提高BC产量，且稀释比2∶8时，BC产量最高。

检测不同黄水稀释比培养基发酵结束后发酵液的BC产率、还原糖消耗量、总酸含量、pH以及BC平均日产量，结果如表2所示。

由表2可知，随着黄水稀释比降低，BC产率呈现先增加后降低的趋势，且所有实验组BC产率都显著高于对照组(10.27%)。BC产率高，表明葡糖醋杆菌消耗相同的还原糖能产生更多的BC。随着黄水稀释比例降低，BC平均日产量、还原糖消耗量也呈现先增加后降低的趋势。还原糖消耗量高，而BC产量不高主要是因为葡糖醋杆菌在消耗葡萄糖合成BC的同时，又将葡萄糖转变成葡萄糖酸和其他酸[31-32]。当稀释比为2∶8时，BC产率和平均日产量均达到最大值，分别为93.77%，0.174 g·d-1·L-1，相比对照组分别提高了813.05%，53.98%。随着黄水稀释比降低，发酵液中酸度和pH逐渐升高；发酵结束后黄水稀释发酵液pH均在4.39～5.85之间，均显著高于对照组(pH3.59)(P<0.05)。Keshk等[33]研究表明葡糖醋杆菌生物合成最适pH为4.0～6.0。葡糖醋杆菌以葡萄糖等还原糖作为碳源发酵合成BC时，会通过自身酶系将葡萄糖转变为葡萄糖酸和其他有机酸[34]，随着发酵过程的进行，葡萄糖酸等逐渐积累，使发酵培养基pH降低[35]，一旦培养基pH降低到葡糖醋杆菌可耐受pH以下，就会导致菌体代谢活性以及数量降低，最终导致细BC产量下降[36]。稀释黄水培养基中含有大量有机酸，在以NaOH调节pH后会形成大量强碱弱酸盐，这些盐类在培养基中能起到一定的缓冲作用，防止BC合成过程中培养液pH快速下降[21]。同时黄水中糖类、有机酸、醇类等丰富的碳源，能减少葡萄糖酸的产生，这样既能维持培养液pH稳定，又能促使培养基中的还原糖合成BC，从而提高BC产率[26]。

表2 不同黄水稀释比培养基发酵结束后理化性质的比较Table 2 Comparison of physicochemical properties of medium with different "yellow water dilution ratio" after fermentation

结果表明，适当黄水稀释比例可以使发酵液的pH维持在BC合成最佳范围内，从而有利BC的生物合成，并提高BC产率。当黄水稀释比为2∶8时，BC产量和BC产率均为最高，因此选择最佳黄水稀释比为2∶8进行后续试验。

2.3 最佳稀释比例培养基发酵过程中BC产量及理化指标变化

将10%葡糖醋杆菌种子液分别接种于2∶8稀释比黄水培养基和HS培养基中，30 ℃静置发酵培养，每两天取样测定BC产量和还原糖含量，结果如图3所示。

图3 发酵过程中剩余还原糖含量和BC产量Fig.3 Reducing sugar content and BC yield during fermentation

由图3可知，HS培养基中BC产量在第10 d达到最大值(1.51 g/L)，2∶8稀释比黄水培养基BC产量在第6 d达到最大值(2.38 g/L)，较HS培养基提前4 d达到最高产量，同时产量也提高了57.62%。HS培养基与2∶8稀释比黄水培养基中剩余还原糖含量随着发酵进程的进行，均呈现逐渐较少的趋势，HS培养基与2∶8稀释比黄水培养基均在第10 d还原糖含量最低，分别为3.88、1.36 g/L，其中HS培养基中前4 d还原糖含量下降速度最快。结果表明2∶8稀释比黄水培养基中的葡糖醋杆菌能更快更多地合成BC，这可能是因为黄水含有丰富的营养成分，能促进葡糖醋杆菌的快速繁殖，加快BC的生物合成，从而使培养基中的BC产量快速达到较高水平[21]。同时2∶8稀释比黄水培养基中消耗更少的还原糖产生更多的BC，这表明葡糖醋杆菌利用了黄水中还原糖以外的其他物质合成BC。

从表3可知，在整个发酵过程中，HS培养基和2∶8黄水稀释培养基中BC产率均呈现先增加后下降的趋势，均在第6 d达到最大产率，分别为9.39%和94.16%，2∶8黄水稀释培养基BC产率较HS培养基提高了9.35倍。HS培养基和2∶8黄水稀释培养基中还原糖消耗率都呈现出逐渐增加的趋势，且HS培养基中的还原糖消耗率均高于同时期2∶8黄水稀释培养基。2∶8黄水稀释培养基相对于HS培养基中消耗了更少还原糖而产生了更多的BC，这与图2的结论一致，原因之一是黄水提供了除还原糖以外其他可以促进或用于葡糖醋杆菌生长和合成BC的营养物质或其前提物质，这也解释了2∶8黄水稀释培养基中BC产率达到90%以上的原因。在整个发酵过程中，HS培养基中总酸含量逐渐增加，pH逐渐降低，最后降至3.59；而2∶8黄水稀释培养基总酸先增加后降低，pH在第6天时降至最低，后波动上升，发酵终pH为4.82，说明2∶8黄水稀释培养基的pH更加稳定，在整个发酵过程中都在葡糖醋杆菌生物合成BC的最适pH范围内(pH4.0～6.0)[33]。Kuo等[31]指出，虽然葡糖醋杆菌可以利用多种糖来合成BC，但葡萄糖等还原糖对BC的转化率很低，主要是因为葡萄糖脱氢酶位于细胞膜上，也将葡萄糖等还原糖转化为细胞外产生葡萄糖酸，从而降低培养物的pH，最终使BC的生物合成受到阻碍，这从另一方面也解释了HS培养基中糖消耗率高而BC产量较低的原因。2∶8黄水稀释培养基的pH更加稳定主要原因可能是虽然葡糖醋杆菌在合成BC的过程中伴随着葡糖糖酸等有机酸类物质的产生，但黄水中的乳酸、乙酸等有机酸及其盐类能够起到很好的缓冲作用，避免BC合成过程中发酵液pH出现快速下降，使培养过程保持在合成BC最佳pH范围内，从而显著提高BC产量[31]。黄水中的乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸及盐除了起到缓冲作用之外，这些酸类也能够进入三羧酸循环或通过经过糖异生途径合成葡萄糖等方式促进BC合成[37-38]。因此，综合发酵过程中BC产量、糖消耗率、pH和酸度来看，2∶8黄水稀释培养基要优于HS培养基，黄水组分起到了良好的缓冲作用和提供丰富的营养物质。

2.4 培养基不同灭菌方式对BC产量及理化指标影响

为探究培养基不同灭菌方式对BC产量及发酵液理化指标的影响，分别将2∶8黄水稀释培养基采用湿热高压灭菌和常温过滤灭菌后，将10%葡糖醋杆菌种子液分别接种于两种培养基中，静置培养14 d，然后测定相应指标，试验结果见表4。由表4可知，过滤除菌培养基BC产量(3.19 g/L)显著(P<0.05)高于湿热高压灭菌(2.38 g/L)，BC产量提高了34.03%；过滤除菌培养基BC产率(107.56%)显著(P<0.05)高于湿热高压灭菌(92.32%)，BC产量和产率提高了34.03%和16.51%。发酵结束后发酵液酸度和pH无明显差异。

高温灭菌造成培养基中的乙醇和乙酸等可挥发性物质损失较大，而过滤除菌对培养基中乙醇和乙酸损失影响较小。Li等[39]指出乙醇氧化所产生的ATP是戊糖磷酸途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶的抑制剂，从而使代谢流量更多的向BC合成方向流入。Sakurai等[40]研究结果也表明葡萄醋杆菌能利用乙醇作为碳源。Hyun等[41]研究也表明，乙醇既可用作为BC合成的碳源，同时低浓度时还会减少葡糖醋杆菌阳性菌突变成不产纤维素阳性菌的概率，并最终提高BC产量。马霞等[26]研究表明，低浓度的乙酸可弥补葡萄糖降解生成ATP的那部分能量，使得葡萄糖转化为纤维素的量增加。Mohammadkazemi等[37]研究表明乙酸可以被活化成乙酰辅酶A进入乙醛酸途径，经糖异生作用形成葡萄糖，而利于BC的生物合成。张丽平等[27]研究也发现乙酸对木醋杆菌合成BC有促进作用。同时，培养基中的乙酸与其他弱酸盐还能起到很好的pH缓冲作用，避免BC合成过程中产生的葡萄糖酸等酸性物质使得培养基pH急剧下降影响BC的合成。以上这些结果充分表明了不同灭菌方式对提升BC产量有显著作用，培养基过滤灭菌方式使乙醇、乙酸等挥发性成分损失较少，而这些挥发性成分既有助于BC的合成，又能为BC的合成提供良好的缓冲环境，最终使得过滤灭菌培养基中BC产量明显高于高压灭菌方式。

表3 培养基pH、总酸含量、BC产率及还原糖消耗率的变化Table 3 Changes of pH,total acid content,BC yield and reducing sugar consumption of medium

表4 不同灭菌方式对BC产量及理化指标的影响Table 4 Effects of different sterilization methods on BC yield and physicochemical indexes

3 结论

黄水虽然酸度高且pH低，但其含有丰富的营养成分，具有极大的利用价值。将黄水用水进行稀释制成不同培养基，然后在不同培养基中接种葡糖醋杆菌静置发酵，发酵结束后测定BC产量和BC产率等理化指标。结果表明，黄水最佳稀释比为2∶8，此时BC产量最高(2.42 g/L)，比对照组HS培养基BC产量(1.58 g/L)提高了53.2%；BC产率为93.77%，比对照组提高了813.05%。同时发酵结束(14 d)后还原糖消耗率和剩余还原糖含量分别为64.84%和1.36 g/L，均低于同时期的对照组。在不同灭菌方式培养基中，过滤灭菌培养基中BC产量为3.19 g/L，BC产率为107.56%，较高压湿热灭菌方式均有明显提高。因此，以黄水为唯一营养源作为培养基，既能提高BC产量，又降低了BC生产成本，同时也为黄水的开发利用和BC的生产提供了新的途径。