黑麦草生长及根系形态对土壤Cd，Pb与石油污染的响应

魏 倩， 周际海,2， 程双怀， 黄永杰， 张 杰， 周守标

(1.安徽师范大学 生命科学学院 安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室, 安徽 芜湖 241000;2.南昌工程学院 江西省退化生态系统修复与流域生态水文重点实验室, 江西 南昌 330099)

科学技术和现代工业的飞速发展，致使人们对石油的需求量越来越高。随着石油开采量的日益上升，在石油开采、运输过程中产生了大量泄漏物和排出物，造成了严重的土壤石油污染。此外，工业生产过程中含重金属的废弃物排放使土壤中的重金属含量增加，同时农业生产过程中化肥及农药的不当使用也会造成土壤污染[1-2]。石油、重金属导致的土壤污染问题亟待解决。现今对污染土壤的修复主要有3类方法，分别为物理修复、化学修复和生物修复。物理修复和化学修复虽然效果明显，但容易造成二次污染，生物修复中的植物修复不仅成本低而且具有良好的生态效应因此获得较多的应用[3-5]。植物修复是利用某些特殊植物的耐受作用，种植在受污染的土壤中，在其自身生长的过程中利用植物的根系，吸收、富集并移除土壤中的有机和无机污染物[6-8]。多年生黑麦草(Loliumperenne)作为水土保持的先锋植物，其以生长快，根系发达，对外界的胁迫具有较好耐受适应性而被经常用来研究在胁迫条件下的生理响应[9]。目前，有很多利用植物修复污染土壤的研究。比如，紫花苜蓿(Medicagosativa)在不同浓度重金属污染的土壤中，随着紫花苜蓿的生长，土壤中重金属含量呈现逐步减少的趋势；红三叶草(Trifoliumpretense)在修复石油污染土壤的后期生物量增大，土壤中总石油烃含量(TPH)降低。证明植物对重金属污染、石油污染土壤具有修复作用[10-11]。众所周知，根系在植物生长过程中具有重要作用，其中根系形态特征与植物利用土壤养分的效率密切相关。有研究[12]表明，车前草在Cu，Ni污染条件下，根部重金属的累积量大于叶片，生物量和叶绿素含量减小；也有研究[13]发现在石油污染土壤中种植牧草，牧草的发芽率和生物量均降低，但土壤中石油的的降解率提高。根系的吸收作用能够使土壤中重金属、石油等污染物的含量明显减少[14-15]，这对于土壤污染的研究与修复具有重大意义。虽然利用植物修复污染土壤的研究较多，但是关于植物根系形态及生长变化在污染土壤修复的研究中报道较少。基于此，本研究模拟重金属、石油及重金属—石油复合污染，通过室内盆栽试验，种植黑麦草，分别对不同类型土壤污染下黑麦草的根系形态、生物量及色素含量的变化进行分析，旨在探讨黑麦草在不同类型污染下的生理生化响应，为植物修复单一污染及复合污染土壤提供初步的植物生理生化机理研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

①供试土壤。2019年3月10日在长江南岸冲积地潮土采集土样(南京雨花台区桥板镇)。用取土器取样，取0—20 cm的土壤，装进自封袋中带回实验室，去除砂石及大颗粒物后过2 mm筛，贮存在4 ℃的冰箱内备用。供试土壤质地为砂质壤土。土壤基本理化性质为：pH值为6.43，有机碳10.87 g/kg，全氮0.89 g/kg，硝态氮27.17 mg/kg，铵态氮5.42 mg/kg，镉0.196 mg/kg，铅为4.52 mg/kg。 ②供试植物。多年生黑麦草(Loliumperenne)，黑麦草种子采购自江苏省农科院。 ③化学试剂。石油来源于中国石化金南油田。PbCl2，CdCl2·4H2O等其他所用试剂均为分析纯，纯度>99.5%。

1.2 试验设计

本研究共设置4个处理： ①未污染土壤，种植黑麦草(未污染处理，SH)； ②土壤中添加铅、镉并种植黑麦草(SGH)； ③土壤中添加石油并种植黑麦草(SPH)； ④土壤中添加铅、镉及石油并种植黑麦草(SPGH)。土壤污染物浓度设定依据《土壤环境质量—建设用地土壤污染风险管控标准试行》[16]。考虑到土壤污染的实际问题，石油污染物依据建设用地的筛选值第一类做参考，石油污染物浓度设为1 000 mg/kg干土；铅、镉污染严重，铅、镉的污染浓度依据管控值的第一类用地标准设置，镉为50 mg/kg干土，铅为500 mg/kg干土。石油、重金属污染土壤的制备参考程坤等人的方法[17]。

盆栽试验：依据试验设计，于2019年3月20日将不同类型污染土壤过2 mm筛后，分装到塑料花盆(高12 cm，上下直径为10 cm和8 cm)中，每盆200 g土壤(干土重)，共4个处理，每个处理12盆，放于光照试验台上培养；放置2 d后，播种黑麦草种子。播种前对黑麦草种子进行表面消毒(浸泡在10%的过氧化氢中20 min)，消毒后用蒸馏水漂洗3次。每盆播种80粒黑麦草种子，待种子萌发后间苗至50株。植物生长期间通过每天称重来保持含水量为田间最大持水量的60%。培养期间保持室内温度25～30 ℃，每天间歇光照14 h，黑暗10 h，光照强度为4 500～7 300 lx，定期随机更换盆栽的位置以减少试验误差。并于播种后10，20，40和80 d进行破坏性采样。每次采样随机选取每个处理的3盆作为3个重复。

1.3 测定方法

1.3.1 植物根系形态与生物量测定 在培养期的10，20，40，80 d时采样，采样时剪掉塑料花盆，直接用自来水淋洗30 min，淋洗至黑麦草根系无土壤，再充分清洗干净后用蒸馏水冲洗2～3次，用吸水纸吸干水分，将植物地上部与根部分开，黑麦草根部采用根系分析系统(WINRHIZO)，对根系的根长、根表面积、根直径和根体积等进行扫描分析(扫描图片色彩为黑白，分辨率为12 800×12 800 dpi)。根系分析完成后，对地上部和根部于105 ℃杀青30 min，80 ℃烘干至恒重，分别称量地上部和根部的重量(精确值0.000 1 g)。

1.3.2 色素含量测定 在80 d破坏性采样时，对黑麦草的叶片进行色素含量的测定。用丙酮—乙醇混合(1∶1)浸提法[18]测定光合色素含量，并计算出叶绿素a，叶绿素b，类胡萝卜素及叶绿素a+b的含量。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著性检验用LSD法(p<0.05)；对试验数据进行统计分析与作图。

2 结果与分析

2.1 不同类型土壤污染对黑麦草根系形态的影响

黑麦草生长期间，各处理的根系根长呈现增长的趋势，石油污染处理的根系根长一直大于未污染处理，重金属污染处理与未污染处理相比呈现出先减小后增加再减小，石油及重金属复合污染处理与未污染处理相比呈现出先增加后减小(图1)。10 d时，重金属污染处理与未污染处理间无显著差异(p>0.05)，石油污染处理、石油及重金属复合污染与未污染处理间差异显著，石油污染处理、石油及重金属污染处理显著增加了约50.70%，33.50%。20 d时，培养时间增加根系增长，其中石油及重金属复合污染根长显著增加，与未污染处理相比，显著增长了约88.10%，石油及重金属污染物的复合作用促进了黑麦草根系根长的伸长。40 d时，根长在污染条件下增加，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的根长均大于未污染处理，3个污染处理组分别增加了约26.50%，26.20%，5.20%。80 d时，石油污染处理的根系根长显著大于未污染处理，显著增加了约26.20%；其他两个处理的根长低于未污染处理。

黑麦草生长期间，未污染处理的根表面积呈现增加的趋势，石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的根系表面积均大于未污染处理；重金属污染处理与未污染处理相比，呈现出先减少后增加再减少的趋势(图1)。10 d时，各污染处理与未污染处理间差异显著(p<0.05)，石油污染处理、石油及重金属复合污染处理显著大于未污染处理，分别显著增加了约52.40%，29.50%，重金属污染显著减少了约16.50%。20 d时，石油及重金属复合污染与其他处理间差异显著，与未污染处理相比，显著增加了约148.60%，约是未污染处理的1.5倍，黑麦草的根系表面积在石油及重金属复合污染条件下增加。40 d时，3个污染处理均大于未污染处理，而重金属污染处理与未污染处理间差异显著，显著增加了约37.80%。80 d时，石油污染处理与各处理间差异显著，且显著大于未污染处理，显著增加了约24.40%。黑麦草生长期间，各处理的根系体积呈现出增加的趋势，未污染处理的根系体积呈增加的趋势，石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的根系体积一直大于未污染处理，重金属污染处理的根系表面积与未污染处理相比呈现出先减少后增加的趋势(图1)。10 d时，石油污染处理、石油及重金属复合污染处理与未污染处理和重金属污染处理间差异显著，与未污染处理相比，石油污染处理、石油及重金属污染处理显著增加了约52.50%，24.30%。20 d时，石油及重金属污染处理与未污染处理间差异显著，显著增加了约221.90%，是未污染处理的2.2倍；而石油污染处理和重金属污染处理均低于未污染处理。40 d时，重金属污染处理的根系体积显著增加，大于其他3个处理，与未污染处理相比，显著增加了约51.90%，其他两个污染处理的根系体积也均大于未污染处理。80 d时，3个污染处理的根系体积均大于未污染处理，其中石油污染处理组根系体积最大，增长了约24.30%。黑麦草生长期间，未污染处理的根系直径呈现出增加的趋势，重金属污染处理、石油及重金属复合污染处理与未污染处理相比，呈现出先减少后增加的趋势，石油污染处理呈现出先增加后减少的趋势(图1)。10 d时，各处理间的根系直径间无显著差异，4个处理间根系直径生长指标大致相同。20 d时，石油及重金属污染处理的根系直径显著大于其他三组处理；与未污染处理相比，石油及重金属污染处理的根系直径显著增加了约32.20%，石油污染处理与重金属污染处理减少了约9.20%和10.40%。40 d时，重金属污染处理的根系直径与石油污染处理间差异显著，且重金属污染处理的根系直径大于其他三组处理。80 d时，各处理间无显著差异，重金属污染处理、石油及重金属复合污染处理大于未污染处理，增加了约11.34%和4.0%，石油污染处理小于未污染处理，减少了约1.80%。

注：SH表示未污染土壤+黑麦草，SGH表示重金属污染土壤+黑麦草，SPH表示石油污染土壤+黑麦草，SPGH表示石油重金属混合污染土壤+黑麦草；不同小写字母表示同一采样时间内不同处理间存在显著差异(p<0.05)。下同。

2.2 不同类型土壤污染条件下黑麦草生物量(干重)的变化

随着黑麦草生长时间的增加，各处理的地下生物量呈现出增加的趋势(表1)。10 d时，石油污染处理、石油及重金属复合污染处理均显著大于未污染处理，显著增加了约73.79%和89.00%。20 d时，石油及重金属复合处理显著大于其他三组处理，与未污染处理相比，显著增加了约169.37%，石油及重金属复合处理的地下生物量约是未污染处理的3倍。40 d时，各处理间无显著差异，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的地下生物量均小于未污染处理，分别减少了约13.43%，12.45%和2.0%。80 d时，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的地下生物量均显著小于未污染处理，分别显著减少约了25.46%，50.76%和34.69%。

表1 不同土壤污染条件下黑麦草地下生物量、地上生物量和总生物量的变化

随着黑麦草生长时间的增加，各处理的地上生物量呈现出增加的趋势，且不同污染类型处理的地上生物量均小于未污染处理(表1)。10 d时，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理间的地上生物量均显著低于未污染处理，分别显著减少了约33.85%，25.78%和34.68%；生长前10 d，各处理的地上生物量表现为：SH >SPH >SPGH >SGH。20 d时，未污染处理与重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理间无显著差异，但重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的地上生物量均低于未污染处理，分别减少了约10.79%，44.64%和20.89%。40 d时，各处理间的地上生物量差异显著，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理与未污染处理相比分别显著减少了约43.29%，27.97%和45.42%。80 d时，各处理间的地上生物量差异显著，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理与未污染处理相比分别显著减少了约28.08%，39.51%和58.02%。在生长的20 d后，各处理的地上生物量表现为：SH>SGH>SPH>SPGH。由表1可以看出，各处理的黑麦草的总生物量随生长时间的变化呈现增加的趋势。10 d时，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的黑麦草总生物量与未污染处理间无显著差异，各处理间总生物量表现为：SPGH>SPH>SH>SGH。20 d时，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的黑麦草总生物量与未污染处理间无显著差异，各处理间总生物量表现为：SGH>SH>SPGH>SPH。40 d时，重金属污染处理、石油及重金属复合污染处理与未污染处理间差异显著，与未污染处理相比，重金属污染处理、石油及重金属复合污染处理的黑麦草的总生物量分别显著降低了约31.98%和28.96%。80 d时，重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理与未污染处理相比分别显著减少了约26.85%，44.84%和47.00%，各处理的总生物量表现为：SH>SGH>SPH>SPGH。

2.3 不同类型土壤污染条件下黑麦草叶片色素含量的变化

图2显示的是不同类型土壤污染条件下黑麦草叶绿素及其他色素含量的变化。由图2可知，各处理的叶绿素a，叶绿素b，类胡萝卜素及叶绿素a+b的含量均低于未污染处理。与未污染处理相比，石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的叶绿素a含量分别显著减少了约41.22%和37.09%，重金属污染处理减少了约10.54%。重金属污染处理、石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的叶绿素b含量与未污染处理相比，分别减少了约16.46%，34.52%和44.56%，其中石油及重金属复合污染处理与未污染处理间差异显著，石油及重金属复合污染对黑麦草叶绿素b含量的影响最大。石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的类胡萝卜素含量与未污染处理相比，分别显著减少了约43.97%和46.72%。石油污染处理、石油及重金属复合污染处理的叶绿素a+b含量与未污染处理相比，分别显著减少了约39.16%和39.22%，且石油污染处理和石油及重金属复合污染处理间无显著差异。本研究发现石油及重金属复合污染对类胡萝卜素和叶绿素a+b影响最大，石油污染处理次之。

图2 不同土壤污染条件下黑麦草叶绿素及色素含量的变化情况

2.4 黑麦草根系、生物量及叶片色素含量间相关性

表2为黑麦草根系各指标、生物量、叶片色素含量的相关性。由表2可知，黑麦草根系根长与叶绿素b含量呈极显著负相关(p<0.01)，与叶绿素a、类胡萝卜素、叶绿素总和呈显著负相关(p<0.05)，根系表面积与根系体积呈极显著正相关(p<0.01)，与根系直径呈显著正相关(p<0.05)，根系直径与根系体积呈极显著正相关(p<0.01)；黑麦草地上生物量与类胡萝卜素呈显著正相关，地下生物量与总生物量呈显著正相关(p<0.05)；叶绿素a与叶绿素b含量呈显著正相关(p<0.05)，与类胡萝卜素、叶绿素总量呈极显著正相关(p<0.01)；叶绿素b与类胡萝卜素、叶绿素总量呈极显著正相关，类胡萝卜素与叶绿素总量呈极显著正相关(p<0.01)。

表2 黑麦草根系各指标、生物量、叶片色素含量间的相关性

3 讨论与结论

一般认为，植物根系的变化，是判断植物自身生长的一个重要指标。本研究通过黑麦草根系的根长、根表面积、根直径和根体积来探究重金属污染、石油污染、石油及重金属复合污染对植物生长的影响。随着生长时间的增加，各处理的黑麦草植株根系变化趋势大致相同。20 d时，石油及重金属复合污染处理各个根系指标均大于其他处理，主要是由于石油特殊的物理性质—疏水性，导致石油污染物进入土壤后，在根系的土壤中形成乳浊液[19-20]，不利于根系吸收水分，抑制了植物根系对养分的吸收。在石油污染物的胁迫作用下，黑麦草根系为了吸收营养物质而促进了根系的伸长、增生，最终使石油污染处理的根系生长大于其他处理。石油、重金属单一污染处理的黑麦草根系变化与石油及重金属复合污染条件下的变化不完全相同，是因为石油、重金属污染性质存在差异，对黑麦草根系形态的影响也会出现不同。整体来看，石油重金属复合污染大于未污染处理，根系各指标在生长前期大于未污染处理，在生长后期，与未污染处理间差异减小。由于污染物的胁迫作用，影响了黑麦草对营养物质和水分的吸收，黑麦草为了维持生长，导致根系出现代偿性增生，使黑麦草的根系根长、根系表面积、根系直径、根系体积增加，促进对营养物质的吸收，以维持黑麦草的生长。有研究发现蚕豆(Viciafaba)、续断菊(Sonchusasper)等耐受植物根系在重金属胁迫下根系根长减小，根系表面积增大[21-24]。这与我们的研究有些不同，主要是不同的植物本身的生长特性，以及对污染物的敏感度不同造成的。本研究发现，石油污染与重金属污染对黑麦草根系的影响差异较大，石油及重金属复合污染与石油污染对黑麦草根系的影响也不同，是因为石油和重金属污染的性质不同，对黑麦草生长的影响也就出现差异，同时石油还会影响黑麦草根系对土壤水分的吸收，进而对黑麦草的生长影响更大。

植物生物量的变化也是判断植物生长情况的一个重要指标。植物在石油和重金属胁迫作用下，生长会受到抑制，使其生物量下降[25-26]。本研究发现，在黑麦草生长前期，由于石油及重金属的胁迫作用，阻碍了黑麦草对营养物质的吸收，植物根系在胁迫作用下代偿性增生，促使黑麦草地下生物量增加；黑麦草生长后期，由于胁迫时间增加，阻碍了营养物质的吸收与运输，导致黑麦草的生长逐渐减弱，黑麦草的生长受到抑制，地下生物量降低。在整个培养期内，3个污染处理的地上生物量均低于未污染处理，主要可归因为根系对营养物质的吸收降低，抑制了根系向地上部分运输营养物质，限制了黑麦草地上部的正常生长，使地上生物量减少[27]。随着时间增加，污染土壤的黑麦草总生物量小于未污染处理，可归因为重金属污染、石油污染及石油—重金属复合污染的毒害作用抑制了黑麦草根部对水分及其他营养物质的吸收与运输而使植物的生长减弱，导致黑麦草生物量减少。

植物叶绿素含量的变化，是反映植物生长的一个重要因素。叶绿素含量的多少可以间接反映出植物受胁迫的程度[28]。本研究表明，重金属污染、石油污染、石油及重金属复合污染处理的叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量及叶绿素a+b含量均显著低于未污染处理，说明重金属、石油及其复合污染都影响植物色素的合成，这和前人的研究结果一致[29-30]。有研究表明，在重金属胁迫下，叶绿素的含量先上升后下降[31]，也有研究显示在镉含量增加的情况下，植物体内的光合色素含量减少[25]。本研究发现，在各污染处理条件下的黑麦草叶绿素及其他色素含量均降低，可归因为重金属污染处理可使叶绿素合成过程中的金属离子形态发生变化，影响叶绿素的合成，使叶绿素含量减少[32-33]。石油污染处理的黑麦草的叶绿素含量小于重金属污染处理的叶绿素含量，可能是由于石油的疏水性，使黑麦草根系吸水困难，吸收水分减少而导致叶绿素的合成减弱，色素合成量降低。本研究发现，单一污染会使黑麦草的叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量及叶绿素a+b含量降低，石油与重金属复合污染存在协同作用，进一步加剧了对黑麦草的胁迫作用，从而影响了黑麦草的叶绿素的合成，使色素含量降低。黑麦草根系根长与色素含量间呈显著负相关(表2)，表明污染胁迫增加了根系的根长，但污染胁迫还是影响了黑麦草对营养物质的吸收，导致色素的合成减少。黑麦草类胡萝卜素含量与地上生物量呈显著正相关，各色素含量间也存在显著正相关，表明在不同污染物胁迫影响下，黑麦草各生长指标间也存在着相互影响。

综上所述，本研究发现石油、重金属及石油—重金属复合污染处理促进了黑麦草根系的根长、根表面积、根体积、根直径的增加。污染条件下黑麦草地下部生物量增长速度在培养期内呈现先快后慢的趋势，对地上部分生物量的增加起到抑制作用，同时使黑麦草叶片的色素含量降低。总体来看，石油—重金属复合污染对黑麦草的根系形态、生长影响最显著，石油污染次之，重金属污染最小。基于此，可通过监测黑麦草的生物量及色素含量来推测土壤是否污染，也可在污染土壤修复过程中，针对不同污染类型，采取相应措施，如添加调理剂、施用营养素等来缓解污染物对植物的胁迫，调节植物的生长，促进植物对土壤污染的修复能力，为植物修复污染土壤提供了新的视角。