海洋石油烃降解菌的固定化及其石油降解性能研究*

刘志敏 赵倩倩 王 傲 乔文竹 宋东辉,2#

(1.天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457；2.天津市海洋资源与化学重点实验室，天津 300457)

海底蕴藏着丰富的石油资源，海洋石油开采给社会带来巨大经济利益的同时也给海洋造成巨大污染，近年来频发的海上漏油事故已成为海洋生态环境的一大威胁[1-2]。石油的主要成分为烷烃和芳香烃，根据化学结构，烷烃可以分为支链烷烃和直链烷烃，而芳香烃是由不同烷基取代的一个或几个芳环组成的一类碳氢化合物[3]，常见的芳香烃包括萘、菲、蒽、芘等化合物，化学性质十分稳定[4-5]。芳香烃类物质对人和动物的毒性影响较大，尤其是多环芳烃[6]，可以通过呼吸、皮肤接触、饮食摄入等方式进入人或动物体内，影响其肝、肾等器官的正常功能，引起癌变[7]。

生物技术是指通过石油烃降解菌来加快石油烃从环境中的去除，近年来被广泛应用于石油烃污染环境的修复过程中[8-11]。与直接投放游离菌剂相比，固定化微生物技术由于具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少等优点，成为环境治理领域的研究热点[12-14]。微生物固定化是指通过物理或化学手段使游离状态的微生物固定在有限的空间，或包埋于高分子材料中，保持生物活性并使之缓慢释放的生物方法[15]。在微生物的固定化方法中，包埋法[16]是最常见的，具有操作简单、对微生物活性影响较小等优点。结合以往研究，壳聚糖可作为一种辅助的载体，与海藻酸钠结合形成一种更加紧密的结构来包裹菌体[17-18]。本实验采用海藻酸钠与壳聚糖作为包埋载体，对石油烃降解菌Acinetobactersp. Tust-DM21(以下简称Tust-DM21)进行固定化，并将固定化小球投放到石油培养基中进行培养并测定石油烃降解率，通过设置不同浓度的海藻酸钠和壳聚糖的混合胶体来对微生物的固定化条件进行优化，考察pH和NaCl浓度对石油烃降解率的影响，为菌株在石油污染修复中的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株及其来源

Acinetobactersp. Tust-DM21菌株为本实验室前期从渤海湾海洋石油勘探船废油收集区中分离得到，存于30%(质量分数)甘油中，-80 ℃冷藏。该菌株已被中国海洋微生物菌种保藏管理中心(http://mccc.org.cn/)收藏，菌株编号MCCC 1K03249，其16S rRNA序列在Gene Bank数据库中的登录号为KX390866。

1.1.2 培养基

LB培养基：酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g溶于1 000 mL蒸馏水中，pH调至7，121 ℃下高压灭菌20 min。

无机盐培养基：KH2PO41.50 g、Na2HPO41.50 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、(NH4)2SO41.00 g、FeSO40.02 g、CaCl20.01 g溶于1 000 mL蒸馏水中，pH调至7，121 ℃下高压灭菌20 min。

石油培养基：在无机盐培养基的基础上，通过实验需求改变pH及NaCl浓度，向其中加入0.06 g已灭菌处理的石油原液。

1.1.3 主要溶液

石油原液：取自天津大港油田，为低硫环烷基类型，密度0.949 g/cm3，石蜡质量分数为5.6%，胶质质量分数为22.0%，不含沥青质。

交联剂溶液：称取CaCl220 g溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃下高压灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液制备

取适量富集培养后的菌株接入LB培养基中，在适宜温度下进行培养。取已经活化后的培养液600 mL，在5 000 r/min下离心5 min，弃上清液，沉淀全部溶于200 mL LB培养基中，制成菌悬液。

1.2.2 固定化小球制备

称取4 g海藻酸钠与1.00 g壳聚糖粉末混匀，加入100 mL蒸馏水制成凝胶。取15 mL凝胶与10 mL菌悬液进行混合，匀速滴至交联剂溶液中，4 ℃交联24 h制成固定化小球。

1.2.3 单因素影响实验

固定化小球制备时，为考察海藻酸钠与壳聚糖对固定化效果的影响，分别调节海藻酸钠质量分数分别为2%、3%、4%、5%、6%(即添加量为2、3、4、5、6 g)，壳聚糖质量分数分别为0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%(即添加量为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g)，其余固定化操作方法同1.2.2节。参考文献[19]，对不同条件下制得的固定化小球进行理化性能测定。将固定化小球放入石油培养基中，室温下摇床培养5 d，测定石油烃降解率。

选择石油烃降解率最高的固定化小球进行后续石油烃降解实验。为考察pH及NaCl对固定化小球降解石油烃的影响，调节石油培养基pH分别为6、7、8、9、10，NaCl质量分数分别为2%、3%、4%、5%、6%，相同条件下培养5 d，测定石油烃降解率。

1.2.4 正交实验

在单因素实验的基础上，选出每个单因素的适宜条件，根据SPSS 22软件设计四因素三水平正交实验方案，正交实验因素水平设计见表1。

表1 正交实验因素水平

1.2.5 游离菌剂与固定化小球石油烃降解效果对比

取100 g土壤置于直径9 cm、高12 cm的花盆中。称取2 g石油原液，将石油原液和二氯甲烷按照1∶1的体积比溶解，均匀喷洒到花盆中，静置通风1周使二氯甲烷挥发完全，制得模拟油污土壤。分别取固定化小球及10 mL菌悬液均匀放入提前处理好的模拟油污土壤中，培养1周后测定土壤中石油烃含量，计算石油烃降解率。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

作为包埋载体，海藻酸钠和壳聚糖浓度过高或过低都不利于固定化小球的成型。海藻酸钠、壳聚糖添加量对固定化小球理化性质的影响分别见表2、表3。在单因素实验中，海藻酸钠为2%或壳聚糖为0.25%时，固定化小球成球效果较差，容易形成絮状不规则的片状体。而海藻酸钠为6%和壳聚糖为1.25%时，形成的固定化小球易出现拖尾现象。小球的密度、稳定性、传质性均随着海藻酸钠和壳聚糖添加量的增加而逐渐增加，小球破碎率则随着两者添加量的增加而逐渐降低。这说明，在相同的交联时间内，包埋载体浓度越大，固定化小球越坚硬。

表2 海藻酸钠对固定化小球理化性质的影响1)

表3 壳聚糖对固定化小球理化性质的影响

包埋载体浓度的高低不仅对固定化小球的成球效果产生影响，同样对石油烃降解率也会产生一定的影响。由图1可以看出，随着海藻酸钠及壳聚糖质量分数的增加，固定化小球的石油烃降解率先逐渐升高。当海藻酸钠为4%、壳聚糖为1.00%时，固定化小球的石油烃降解率达到最大，分别为79.3%、88.8%。继续增加海藻酸钠及壳聚糖添加量，石油烃降解率又逐渐下降。

图1 包埋载体质量分数对固定化小球石油烃降解率的影响Fig.1 Effect of embedding carrier dosage on petroleum hydrocarbon degradation rate of immobilized pellets

综合考量固定化小球的理化性能及石油烃降解效果，海藻酸钠质量分数宜为4%，壳聚糖质量分数宜为1.00%。

除包埋载体添加量外，pH和NaCl浓度也会对固定化小球的石油烃降解率产生影响。根据前期实验结果，采用海藻酸钠质量分数为4%，壳聚糖质量分数为1.00%下制得的固定化小球进行后续石油烃降解实验。

由图2(a)可见，在pH为6～9时，固定化小球对石油烃降解率随pH的升高先增大后减小，当pH为9时，石油烃降解率达到最大值74.1%。由图2(b)可见，当NaCl质量分数为3%～5%时，石油烃降解率随NaCl质量分数的升高而缓慢升高，当NaCl质量分数达到5%时，石油烃降解率达到最大，为76.9%。当NaCl质量分数超过5%时，石油烃降解率出现明显降低。由此可知，采用固定化小球对石油烃进行降解时，pH宜为9，NaCl质量分数宜为5%。

图2 pH及NaCl对石油烃降解率的影响Fig.2 Influence of pH and NaCl on the petroleum hydrocarbon degradation rate

2.2 正交实验结果

固定化小球对石油烃降解的正交实验结果见表4。9组实验中，第8组实验的石油烃降解率最高，为87.5%，最优组合为A2B2C1D3，由不同因素的R值可知，pH对石油烃降解率的影响最大。由表5可以看出，4个因素对石油烃降解率影响程度为pH>NaCl>壳聚糖>海藻酸钠，其中，pH的P值为0.025，小于0.05，是显著影响因素。

表4 正交实验结果

表5 正交实验方差分析1)

根据SPSS 22软件，计算4个因素在不同水平下石油烃降解率的估算边际平均值，估算边际平均值越高，表示该水平下石油烃降解效果越好。从图3可以看出，海藻酸钠、pH、NaCl的最优水平分别为4%、7和5%，当壳聚糖质量分数为0.75%、1.00%时，石油烃降解率估算边际平均值相近，但考虑到壳聚糖为1.00%时固定化小球的理化性质更佳，故认为壳聚糖的最优水平为1.00%，这与正交实验得到的最佳优化组合一致，因此，固定化小球对石油烃降解的最优条件为海藻酸钠质量分数为4%、壳聚糖质量分数为1.00%、pH为7、NaCl质量分数为5%。

图3 石油烃降解率估算边际平均值Fig.3 Estimated marginal average of petroleum hydrocarbon degradation rate

2.3 游离菌剂与固定化小球石油烃降解效果

经过1周的培养，游离菌剂对模拟油污土壤中石油烃的降解率为45.9%，而固定化小球对石油烃的降解率为70.6%，比游离菌剂提高24.7百分点，表明微生物菌剂在固定化后对石油污染土壤的修复效果更好。

3 讨 论

石油烃降解菌能够以石油烃作为唯一碳源进行生长，为其生长繁殖提供所需的能量，经过一系列氧化还原、分解合成等自身代谢反应，将石油降解成无害的CO2与H2O，对石油污染环境具有很好的修复作用[20-22]。但石油烃组分差异较大，所以降解的难易程度也存在一定的差异，TIZZARD等[23]研究发现，微生物对不同烃类降解的先后次序为短链直链烷烃、长链直链烷烃、分支烷烃、单环芳烃、多环芳烃、杂环芳烃。微生物降解烃类物质主要是利用体内各种酶与石油烃及其中间产物发生脱氢作用、羟化作用和过氧化作用，在这些过程中，既包括有氧降解也包括厌氧降解，其中有氧降解占主导，而厌氧降解由于环境条件限制只能降解较少烃类[24]。刘五星等[25]通过接种石油烃降解菌、添加有机肥及调理剂等方式对含油污泥进行预制床生物修复，经过230 d的修复处理，修复效率高达46.3%。本实验所用的菌株Tust-DM21在前期全基因组测序中发现168个可能与石油烃降解相关的基因，包括常见的烷烃降解基因alkB、细胞色素p450编码基因、常见的芳烃降解基因儿茶酚1,2-双加氧酶以及一些其他双加氧酶、单加氧酶等的编码基因[26]。将菌株Tust-DM21在海藻酸钠质量分数为4%，壳聚糖质量分数为1.00%的条件下进行固定化来降解培养基中的石油烃，在pH为7，NaCl质量分数为5%下培养5 d，石油烃降解率可高达80%以上，明显高于他文献中的石油烃降解率，这可能是因为本研究所用培养基都经过高温灭菌，没有杂菌干扰，降解效果会比较明显，同时也说明菌株Tust-DM21具有高效性，能够在较短的时间内高效率地降解石油。

固定化技术具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少等优点，目前已成为生物、环境等领域的研究热点[27]。在本实验中，用海藻酸钠和壳聚糖作为包埋载体对浓缩的菌悬液进行固定化包埋，固定化后的菌剂对石油烃有更高的降解效率，这跟包埋载体具有特殊的内部结构有着很大的关系。胡晓亮等[28]研究表明，游离菌剂在包埋载体中能够利用海藻酸钠作为碳源生长，繁殖速度快，生长数量多。另外，李馨子等[29]通过对固定化小球进行电镜观察发现包埋载体有特殊的孔隙结构，能够保持良好的传质性，同时还可以保证细菌正常的生理代谢，又能屏蔽外界不利因素的侵害，有利于细菌在颗粒内部生长繁殖，且细菌在交叉曲折网络结构中不易泄漏，小球内可以维持较高的细菌密度，因此固定化后的菌剂可以保持较高的降解效率。苏增建等[30]利用海藻酸钠为包埋载体，对石油烃降解菌进行固定化，用CaCl2交联固定化小球并用于石油烃降解，得到海藻酸钠最适质量分数为4%，石油烃降解率最高为48.7%。吕荣湖等[31]利用海藻酸钠和聚乙烯醇(PVA)作为包埋载体，利用CaCl2交联微生物固定化小球，处理6 h后，固定化小球的除油率达到86%以上。考虑到PVA本身属于高分子材料，具有一定毒性，从成球效果和石油烃降解效果上看，壳聚糖更适合作为固定化小球的包埋载体[32]。在考虑环境因素对固定化微小球降解率的影响时，本研究只探讨了pH和NaCl质量分数对微生物菌剂成球效果和石油烃降解率的影响。在单因素实验中，pH为9、NaCl质量分数为5%时，菌株对于石油烃的降解率在70%以上。这个结果与姜天翔等[19]在pH为7.5、盐度为3.3%、温度为35 ℃时，微生物对石油烃降解率达90%以上的报道有所差别，这可能是由于本研究所用菌株Tust-DM21来自海洋石油勘探船废油收集区，菌株所处环境复杂，且石油烃浓度较低，其活性适宜于降解较低浓度石油，但耐盐性和耐pH的程度比较高。

4 结 论

利用包埋法对前期分离纯化的石油烃高效降解菌Tust-DM21进行固定化，根据固定化小球的理化性质和石油烃降解性能，利用四因素三水平的正交实验对固定化参数进行优化，发现如下结论：(1)4个因素对石油烃降解率影响程度为pH>NaCl>壳聚糖>海藻酸钠，其中pH为显著影响因素；(2)石油烃降解的最佳条件为海藻酸钠质量分数4%、壳聚糖质量分数1.00%、pH=7、NaCl质量分数5%；(3)游离菌剂与固定化小球对模拟油污土壤中石油烃的降解率分别为45.9%、70.6%，石油烃降解菌经固定化后具有更好降解效果。综上，菌株Tust-DM21能够在优化条件下高效率地降解石油，且固定化处理后的菌剂石油烃降解效果比游离菌大幅升高，在石油污染的现场修复中具有更高的应用价值。