金钗石斛多糖调控炎性小体NLRP3对非酒精性脂肪肝大鼠的保护作用

范艳 喻涓 杨榆青 何丹 姚政 宋波

摘要 目的：研究金釵石斛多糖对NAFLD大鼠的干预作用，并从NLRP3信号通路分析作用机制。方法：将72只SD大鼠分为正常、模型、金钗石斛多糖高、中、低剂量和多烯磷脂酰胆碱干预组，除正常组外，NAFLD模型构建成功治疗4周后处死，取出肝脏检测肝脏病理学和NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表达，收集血液检测谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）含量。结果：正常组肝小叶清晰，细胞核分布均匀，模型组有明显脂肪空泡和炎症反应浸润，金钗石斛多糖与多烯磷脂酰胆碱组明显改善;与正常组比较，模型组AST、ALT、TG、TC、HDL-C、LDL-C、IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3蛋白及mRNA均升高（P<0.05），与模型组比较，金钗石斛多糖组和多烯磷脂酰胆碱组上述指标均降低（P<0.05），此外金钗石斛多糖组与多烯磷脂酰胆碱组AST、ALT和HDL-C没有差异，高剂量组TG、TC和LDL-C低于多烯磷脂酰胆碱组（P<0.05），中和高剂量组IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3蛋白及mRNA明显低于多烯磷脂酰胆碱组（P<0.05）。结论：金钗石斛多糖可明显改善高脂高糖饮食诱导的NAFLD大鼠肝功能和血脂，这与其可调节炎性小体NLRP3，进而降低炎症反应有关。

关键词 金钗石斛多糖;非酒精性脂肪肝;大鼠;血脂;炎症介质;炎性小体;NOD样受体蛋白3;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

Protective Effects of Dendrobium Nobile Polysaccharide on NLRP3 in Rats with Nonalcoholic Fatty Liver Disease

FAN Yan1，2，YU Juan3，YANG Yuqing2，HE Dan2，YAO Zheng2，SONG Bo2

（1 School of Basic Medicine，Kunming Medical University，Kunming 650500，China; 2 School of Basic Medicine，Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming 650504，China; 3 School Hospital，Yunnan Normal University，Kunming 650500，China）

Abstract Objective：To investigate the intervention effect of Dendrobium nobile polysaccharides on NAFLD rats，and to analyze the mechanism of action from the NLRP3 signaling pathway.Methods：A total of 72 SD rats were divided into 6 groups，which were the normal，model，high dose，medium dose，low dose Dendrobium nobile polysaccharide，and the polyene phosphatidylcholine intervention group.Except for the normal group，the other 5 groups were constructed an animal model of NAFLD and after treatment，the rats were sacrificed.Their liver was taken out to detect liver pathology and NLRP3，Caspase-1 protein and mRNA expression.Their blood was also collected to detect the AST，ALT，TG，TC，LDL-C，HDL-C，IL-1β and IL-18.Results：The liver lobules in the normal group were clear，and the nuclei were evenly distributed.The model group had obvious fatty vacuoles and inflammatory reaction infiltration.The Dendrobium nobile polysaccharide and polyene phosphatidylcholine group improved significantly.Compared with the control group，AST，ALT，TG，TC，HDL-C，LDL-C，IL-1β，IL-18，Caspase-1 and NLRP3 protein and mRNA were significantly increased in the model group（P<0.05）.Compared with the model group，those indexes in the Dendrobium nobile polysaccharide and the polyene phosphatidylcholine group were significantly lower（P<0.05）.In addition，there was no difference in AST，ALT and HDL-C between the Dendrobium nobile polysaccharide group and the polyene phosphatidylcholine group.TG，TC and LDL-C of the high-dose group were lower than those of the polyene phosphatidylcholine group（P<0.05）.The protein and mRNA of IL-1β，IL-18，Caspase-1 and NLRP3 in the high-dose group were significantly lower than those in the polyene phosphatidylcholine group（P<0.05）.Conclusion：Dendrobium nobile polysaccharides can significantly improve the liver function and blood lipids of NAFLD rats induced by a high-fat and high-sugar diet，which is related to its ability to regulate the inflammasome NLRP3，thereby reducing the inflammatory response.

Keywords Dendrobium nobile polysaccharide; Nonalcoholic fatty liver disease; Rat; Blood lipids; Inflammatory factors; Inflammasome; Nod-like receptor protein-3（NLRP3）; Caspase-1

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.007

有研究显示，当前非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）在我国发病率逐年升高，目前国内约有1.5亿NAFLD患者，已经超过病毒性肝病，成为发病率最高的肝脏疾病[1]。NAFLD病理学主要表现为肝脏过度脂肪蓄积，进而引起肝细胞实质脂肪变性[2]。本病发生后需积极控制，若控制不佳，有很大概率可随病情进展发展为脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝功能衰竭或肝癌等[3]。因此对本病的积极防治特别重要。目前临床中对于本病的治疗，西药以降糖、降脂和提高抗氧化能力以及消炎为主[4]，但治疗效果欠佳。金钗石斛多糖是中药金钗石斛最主要的有效药理成分之一，作为我国九大仙草之首，石斛在抗癌、消炎、抗氧化等多方面均呈现出较好的效果[5]，其是否对NAFLD有治疗作用还缺少相关研究证实，为此本研究成功复制了NAFLD模型，从炎性小体NLRP3途径探讨金钗石斛多糖对其的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性SD大鼠72只，体质量160～180 g，由昆明医科大学动物实验中心提供[动物许可证号：SCXK-（云）2011-004]，大鼠在購买后饲养于云南中医药大学动物实验中心，饲养条件按照国际标准，其中湿度40%～60%，温度22～26 ℃，光照/黑暗（12 h/12 h），日常由其自由饮水，此外普通饲料和高脂饲料也由昆明医科大学动物实验中心配置并提供。

1.1.2 药物 金钗石斛多糖（纯度98%，上海融禾医药科技发展有限公司，生产批号：180317）;多烯磷脂酰胆碱[赛诺菲（北京）制药有限公司，生产批号：180122];戊巴比妥（上海信裕生物科技有限公司，生产批号：170821）;多聚甲醛溶液（淄博齐星化学科技有限公司，生产批号：180906）。

1.1.3 试剂与仪器 苏木精-伊红（HE）染料（广州晶欣生物科技有限公司，货号：JX078）;BCA蛋白定量试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司，货号：SK3021）;PVDF膜（Sigma公司，美国，货号：IPVH00010）;ECL超敏发光试剂盒（江苏碧云天生物公司，货号：P0018FS）;β-肌动蛋白抗体（Actin抗体，货号：W025-1-1）、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase，AST，货号：C010-2-1）和丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase，ALT，货号：C009-2-1）购自南京建成生物工程研究所;血清白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6，货号：CSB-E04640r）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α，货号：CSB-E11987r）购自武汉华美生物工程有限公司;NOD样受体蛋白3（Nod-like Receptor Protein-3，NLRP3，货号：sc-365202）和天冬氨酸蛋白水解酶1（Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase1，Caspase-1，货号：56036）抗体购自美国Santa cruz公司;引物由上海生物生工设计并生产。酶标仪（北京普天新桥技术有限公司，型号：PT-3502）;分光光度计（上海精密科学仪器有限公司，型号：752N）;光学显微镜（上海光学仪器厂，型号：XSP-9CA）;石蜡切片机（徕卡，德国，型号：EM UC7）;梯度脱水机（湖北徕克医疗仪器有限公司，型号：PPDT-12C1）;蛋白电泳仪（伯乐，美国，型号：Mini-PROTEAN Tetra）;实时荧光定量PCR仪（应用生物系统公司，美国，型号：StepOne TM）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 所有大鼠在购买后即称重后按照体质量大小分组，分为正常组、模型组、阳性药物多烯磷脂酰胆碱组、金钗石斛多糖高剂量组、金钗石斛多糖中剂量组、金钗石斛多糖低剂量组，分组后适应性喂养1周（只给予普通饲料，自由饮水），1周后，正常组仍给予普通饲料，其余5组则给予高脂高糖饲料喂养，喂养时间共8周，8周后检验造模是否成功（每组各取2只大鼠处死，肝脏HE染色肝脏有明显脂肪空泡浸润则证明造模成功）。

1.2.2 给药方法 造模成功后，多烯磷脂酰胆碱组给予23 mg/kg多烯磷脂酰胆碱治疗，给药1次/d（给药时将多烯磷脂酰胆碱溶于2 mL生理盐水中），金钗石斛多糖高、中和低剂量组分别给予金钗石斛多糖200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg剂量治疗，给药1次/d（给药时将金钗石斛多糖溶于2 mL生理盐水中），正常组和模型组则给予生理盐水2 mL灌胃治疗，用药4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 血清生化指标检测 三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的测定交由云南省第三人民医院完成，检测仪器为全自动生化分析仪，结果自动导出。谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）检测的测定严格按照试剂盒提供的说明书进行，采用比色法;白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）检测的测定严格按照试剂盒提供的说明书进行，采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）。

1.2.3.2 肝脏组织病理学检查 采用HE染色观察肝脏组织病理学，制作时将肝脏从4%的多聚甲醛溶液中取出，自来水反复冲洗24 h，脱水干燥后、包埋、切片、常规HE染色即完成，中性树脂封片后用带有照相功能的显微镜观察即可，每个组织随机选取4个不同的视野。

1.2.3.3 蛋白表达检测方法 根据试剂盒说明书，用组织裂解液将肝脏组织充分裂解后离心，对其上清液定量，完成后根据BCA试剂盒提供的说明书，测定蛋白含量并将其调平，然后每组各取50 μg行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后常规转模、脱脂牛奶封闭、一抗过夜孵育（NLRP3（1∶3 000），Caspase-1（1∶2 000），β-actin（1∶5 000）孵育后洗涤，加入二抗（1∶5 000）孵育，最后暗室曝光洗片即可，结果以检测蛋白的灰度值与β-actin灰度值的比值表示，每组实验重复3次。

1.2.3.4 mRNA检测方法 根据试剂盒说明书严格操作，提取总RNA后，将其逆转录成cDNA，每组各取1 μL对其进行定量调平，然后每组取2 μg行QT-PCR扩增反应，扩增条件为95 ℃ 2 min、94 ℃10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 40 s，循环次数36次。分析方法选用2-△△Ct法，引物序列：NLRP3为F：ATCAACAGGCGAGACCTCTG，R：GTCCTCCTGGCATACCATAGA，产物长度：96 bp;Caspase-1为F：AATACAACCACTCGTACACGTC，R：AGCTCCAACCCTCGGAGAAA，产物长度：78 bp;β-actin：F：GGCTGTATTCCCCTCCATCG，R：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT，产物长度：154 bp，每组实驗重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。经检验所有数据均符合正态分布，多组间比较采用F检验，2组之间比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金钗石斛多糖对NAFLD大鼠一般状态的影响  在整个实验过程中，正常组大鼠精神和活动量正常，毛色顺滑发亮，饮食和大小便也没有异常，模型组则出现明显活动量降低，毛色发黄粘连，饮食在造模期较正常组高，在造模成功后相较于正常组有一定减少，大便糖稀明显发臭，与模型组比较，金钗石斛多糖3个剂量组和多烯磷脂酰胆碱组上述症状均有一定改善，此外各组大鼠均无死亡。

2.2 金钗石斛多糖对NAFLD大鼠血清生化指标的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝功能指标AST和ALT、血脂指标TG、TC、HDL-C和LDL-C均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），与模型组比较，金钗石斛多糖3个剂量组和多烯磷脂酰胆碱组肝功能指标AST和ALT、血脂指标TG、TC、HDL-C和LDL-C均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），此外金钗石斛多糖3个剂量组与多烯磷脂酰胆碱组AST、ALT和HDL-C比较，差异无统计学意义，而金钗石斛多糖高剂量组血脂指标TG、TC和LDL-C均明显低于多烯磷脂酰胆碱组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、表2。

2.3 金钗石斛多糖对NAFLD大鼠血清IL-1β、IL-18的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清炎症介质指标IL-1β和IL-18明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），相较于模型组，多烯磷脂酰胆碱组和金钗石斛多糖3个剂量组IL-1β和IL-18均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。此外，金钗石斛多糖中剂量和高剂量组IL-1β和IL-18明显低于多烯磷脂酰胆碱组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 金钗石斛多糖不同给药剂量对大鼠肝脏组织病理学的影响 大鼠肝脏病理学可见，正常组肝小叶结构清晰，肝细胞无脂肪变性，细胞核清晰分布于细胞中心;模型组大鼠则出现明显的脂肪脂滴浸润，细胞结构破坏，肝小叶不清晰，肝细胞肿胀，同时细胞核明显受到挤压，多烯磷脂酰胆碱和金钗石斛多糖3个剂量治疗后，上述症状均有不同程度的改善，脂肪颗粒明显减少，肝小叶清晰。见图1。

2.5 金钗石斛多糖对大鼠肝脏细胞蛋白Caspase-1和NLRP3蛋白及mRNA表达的影响 模型组大鼠Caspase-1和NLRP3蛋白及mRNA表达相对于正常组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），金钗石斛多糖低、中、高剂量和多烯磷脂酰胆碱组相对于模型组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。此外金钗石斛多糖中剂量组和高剂量组明显低于多烯磷脂酰胆碱组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2，表4。

3 讨论

当前关于NAFLD的发生机制还没有完全明显，脂代谢异常、脂质过氧化、胰岛素抵抗、遗传、激素使用不当、环境和药物不良反应等均可能参与了本病的发生或发展[6-7]。1998年，Day等[8]将多种因素整合认为NAFLD的发病机制为“二次打击学说”。二次打击学说认为，第一次打击主要是由于胰岛素抵抗所引起的肝脏脂肪过度堆积，而胰岛素抵抗的发生核心又与人们日常高脂高糖饮食摄入增加密切相关;第二次打击则主要是由于肝脏细胞受损，所引起的细胞内环境对肝细胞的自我伤害，这些因素包括氧化应激、脂质过氧化、炎症反应等。由于实验室的特殊性，模仿出一个和人类病理过程较为相似的动物模型对药理学的开发具有积极的意义。本研究我们选用了较多的高脂高糖饮食所构建的NAFLD模型[9-10]，本模型可模拟出胰岛素抵抗型的动物模型，此外相较于基因剔除小鼠，本模型重复性高，价格便宜。从研究结果中可以看出，正常组大鼠切片正常，而模型组则出现大量脂肪空泡，这证明了我们所构建的NAFLD模型是成功的，可以用于后续药理学实验的开发。

目前对于NAFLD的治疗，国内外推荐采用有氧运动锻炼法，但是最新的研究发现[11]，通过物理锻炼虽可以有效的降低肝脏脂类和血脂含量，但是对于发生损坏的肝脏细胞是不可修复的，因此药物的治疗仍是需要的。对于NAFLD的西药治疗，目前主要采取的是针对病因对症疗法，通常给予的药物主要有改善胰岛素抵抗、提高抗氧化能力、降脂类药物和抗细胞因子释放药物4类，但治疗效果不佳，特别是预后较差的问题依然突出[12-13]。中医药在治疗NAFLD方面也积累了大量的经验，同时也形成了自己独特的治疗理念，以多糖类药物为例，多糖类物质是生命活动必不可少的一类重要物质，植物体内的多糖类物质主要由多个单糖和其衍生物聚合所构成，近年来许多学者采用多糖类物质治疗NAFLD[14-16]，效果较好。金钗石斛多糖是金钗石斛主要药理活性成分之一，其在抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等方面均有较好的效果，此外其在降脂方面也有报道[17]。为此本研究采用金钗石斛多糖治疗NAFLD大鼠，研究发现，金钗石斛多糖治疗NAFLD后，大鼠肝脏病理学明显好转，肝功能明显改善，血脂明显改善，这提示金钗石斛多糖可以用于NAFLD的治疗。

炎性小体近年来研究较广，其在NAFLD、糖尿病肾病以及心肌损伤方面均有报道[18-19]。炎性小体主要功能为参与免疫防御，当细胞在受到外界因素刺激或细胞受到感染后，其可激活Caspase-1蛋白，而Caspase-1蛋白的激活和分泌的增加又可以进一步自我激活并诱发炎症介质IL-1β和IL-18的释放，以起到对机体的保护作用[20]。炎性小体种类较多，目前研究较多的主要为LRP1、IPAF、NLRP3和AIM等，其中NLRP3研究最为广泛，此外NLRP3可参与多种代谢性疾病和多种免疫性疾病，包括多发硬化、动脉粥样硬化、中风、老年痴呆等都是其的范畴[21]。目前关于NAFLD和NLRP3与NAFLD的研究也有报道[22]。本研究采用金钗石斛多糖治疗NAFLD大鼠，考察对NLRP3和Caspase-1蛋白及mRNA表达的影响。研究结果发现，与模型组比较，金钗石斛多糖可明显降低NAFLD大鼠肝脏中NLRP3和Caspase-1的表达，此外降低趋势好于目前临床中常用的保肝药物多烯磷脂酰胆碱，这进一步提示金钗石斛多糖对NAFLD具有明显的调节作用。

综上所述，金钗石斛多糖可明显改善高脂高糖饮食诱导的NAFLD大鼠一般状态、改善肝功能、调节血脂，同时减缓炎症反应浸润，其作用机制可能与金钗石斛多糖能够促使炎性小体NLRP3的蛋白及mRNA表达降低，进而调控下游因子IL-1β和IL-18有关。

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（2019-07-06收稿 责任编辑：王明）