当归药材及当归身饮片高效液相色谱特征图谱研究

2021-06-24孟颖池玉梅严国俊曹杰楠王媛媛夏梦莹潘金火

世界中医药 2021年4期

孟颖池玉梅严国俊曹杰楠王媛媛夏梦莹潘金火

摘要目的：建立當归药材及当归身饮片高效液相色谱（HPLC）特征图谱，并通过对当归药材和当归身饮片特征图谱的比较分析，为当归药材和当归身饮片的质量控制提供参考依据。方法：采用Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%乙酸为流动相，梯度洗脱，检测波长为280 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量20 μL;采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对3产地15批当归药材及相应当归身饮片进行相似度评价，建立当归药材及当归身饮片HPLC特征图谱。结果：以阿魏酸为参照峰，构建了由阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H和藁本内酯4个特征峰组成的当归药材及当归身饮片HPLC特征图谱，15批当归药材相似度>0.96，15批对应当归身饮片相似度>0.97，当归药材与当归身饮片特征图谱相似，但各成分含量高低存在差异。结论：本研究建立的方法稳定可靠，重现性好，可为当归药材和当归身饮片质量控制提供参考，为含当归或当归身的经典名方的开发研究提供依据。

关键词当归;当归身;特征图谱;质量控制;经典名方

Research on HPLC Specific Chromatogram of Angelica sinensis and Angelica Body Decoction Pieces

MENG Ying，CHI Yumei，YAN Guojun，CAO Jienan，WANG Yuanyuan，XIA Mengying，PAN Jinhuo

（College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective：To establish the HPLC specific chromatogram of Angelica sinensis and Angelica sinensis body，and to provide reference for the quality control of Angelica sinensis and Angelica body by the comparative analysis of the characteristic maps of Angelica sinensis and Angelica body.Methods：The HPLC analysis was performed on an Symmetry C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm） with acetonitrile-0.2% acetic acid solution as the mobile phase with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 280 nm.The column temperature was 30 ℃.The flow rate was 1.0 mL/min，and the injection volume was 20 μL; Similarity evaluation system of chromatographic fingerprint of Chinese medicine was used to evaluate the similarity of 15 batches of Angelica sinensis and Angelica body in 3 production areas，and to establish the characterisics fingerprint of Angelica sinensis and Angelica body.Results：The specific chromatogram was preliminarily constructed and 4 common peaks of ferulic acid，senkyunolide I，senkyunolide H and ligustilide with ferulic acid as the reference were identified.The similarity of 15 batches of Angelica sinensis was greater than 0.96，and the similarity of 15 batches of angelica body was greater than 0.97.The characteristics of the HPLC specific chromatogram of Angelica sinensis and angelica body were similar，but the content of each component was different.Conclusion：The method is stable，reliable and reproducible，and can be used for quality control of Angelica sinensis and angelica body，and provide a basis for the development of famous classical formulas containing Angelica sinensis or angelica body.

Keywords Angelica sinensis; Angelica body; Specific chromatogram; Quality control; Famous classical formulas

中图分类号：R282;R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.003

当归为伞形科植物当归[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根，其香气浓郁，性温，味甘、辛，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效[1]，具有“血中之气药”“补血之要药”“妇科之良药”等称号。当归药用历史悠久，许多经典名方以其入药，仅2015年版《中华人民共和国药典》一部中收录的含当归中成药就有288种[2]，素有“十方九归”之称。2018年国家中医药管理局公布的《古代经典名方目录（第一批）》中[3]，100首经典名方中共有24首用到当归，其中“清胃散”和“圣愈汤”2方以“当归身”入药。当归不同部位具有截然不同的功效，其中当归身主补血，亦有养血之效。当归中主要含有挥发油类、有机酸类、多糖类、黄酮类、氨基酸类、呋喃香豆素衍生物等化学成分及大量微量元素，现代药理

學研究发现，其具有舒张胃肠平滑肌、抗氧化、改善造血功能、改善血液循环、抗血栓、镇痛抗炎、抗肿瘤、抗抑郁、平喘、保肝强肾健体、增强免疫力、抗辐射损伤等多种功效[4-9]。2015年版《中华人民共和国药典》中其含量测定仅以阿魏酸为质量控制指标，难以全面评价当归药材的质量。中药高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）特征图谱是对中药整体性的化学表征，信息量大，特征性强，本研究通过建立当归药材及当归身饮片HPLC特征图谱，以期对当归药材及当归身饮片质量进行整体控制，有效评定当归药材及当归身饮片的质量标准，为含当归或当归身的经典名方的开发研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2998 PDA检测器，电子天平（上海精密科学仪器有限公司，型号：FA-1104N），电子天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司，型号：MS-105DU），超声波清洗机（赛飞中国有限公司，型号：Biosafer-SB25-12DTD），电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-9023A），正方形调节式中药切片机（瑞安市百信药机器械厂，型号：HK-168），多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司，型号：400Y）。

1.2 试剂无水乙醇（上海泰坦化学有限公司，批号：20035273，分析纯），甲醇（美国天地有限公司，美国，批号：20065184，色谱纯），乙腈（美国天地有限公司，美国，批号：20035273，色谱纯），冰乙酸（阿拉丁试剂有限公司，批号：A2007065，分析纯），磷酸（南京化学试剂有限公司，批号：13040910475，分析纯），甲酸（阿拉丁试剂有限公司，批号：E1830032，分析纯），纯净水（怡宝，批号：6832003260J）。

1.3 分析样品阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，货号：110773-201614，99.0%），洋川芎内酯I对照品（南京金益柏生物科技有限公司，货号：17121105，98.0%），洋川芎内酯H对照品（南京金益柏生物科技有限公司，货号：17121106，98.0%），藁本内酯对照品（南京金益柏生物科技有限公司，货号：20032701，98.62%），15批不同产地当归样品来源信息见表1，经南京中医药大学刘训红教授鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.2%乙酸（B）;梯度洗脱，洗脱程序见表2;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;检测波长：280 nm;进样量：20 μL。

2.2 对照品溶液的制备 1）单一对照品贮备液制备：分别取阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H和藁本内酯对照品适量，精密称定，置于10 mL棕色容量瓶，加入甲醇溶解并定容到刻度，制成含阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H和藁本内酯浓度分别为871 μg/mL、176.8 μg/mL、355 μg/mL和690.34 μg/mL的单一成分对照品贮备液。2）混合对照品制备：精密量取以上4种对照品贮备液适量，置于10 mL棕色容量瓶，加甲醇制成含阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H和藁本内酯浓度分别为17.42 μg/mL、7.07 μg/mL、17.75 μg/mL和138.07 μg/mL的混合溶液作为对照品溶液，低温避光保存。

2.3 当归身饮片的制备取当归原药材，置挑选工作台上，人工除去杂质、异物及非药用部位（残留的草质茎、须根、归头、归尾）。清水洗5 min，中途等间隔时间喷水雾3次，当归身药材外覆湿布，润制12 h，至内无干心、软硬适度、药透水尽。将切药机刀片厚度调至1～2 mm，异形片数<10%，切制后立即置于电热恒温鼓风干燥箱50 ℃低温干燥150 min，过6目筛，水分含量<10%，即得。

2.4 供试品溶液的制备分别将当归药材、当归身饮片打粉，过3号筛，取粉末约0.2 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密吸取70%乙醇20 mL，摇匀，密塞，称定重量。超声（45 kHz，30 ℃，300 W）处理30 min。取出，放至室温，再次称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀。过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.5 专属性试验取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液，分别采用“2.1”色谱条件，进行HPLC色谱测定。样品与对照品在同一保留时间有相同的峰出现，而空白溶剂则无相应的峰，证明实验专属性良好。

2.6 中间精密度试验取批号为DG-18009的当归药材粉末，按“2.4”项下制备样品，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录色谱图。以阿魏酸的保留时间和峰面积为参照，测得4个特征峰的相对保留时间RSD为0.02%～0.05%，均<0.5%，相对峰面积RSD为0.37%～0.93%，均<3.0%，表明仪器精密度良好。

2.7 供试品溶液稳定性试验

取批号为DG-18009的当归药材粉末，按“2.4”项下制备样品，在“2.1”项色谱条件下于0、3、6、9、12、18、24 h进样，记录色谱图。以阿魏酸的保留时间和峰面积为参照，测得4个特征峰的相对保留时间RSD为0.23%～0.46%，均<0.5%，相对峰面积RSD为0.57%～1.68%，均<3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取批号为DG-18009的当归药材粉末6份，按“2.4”项下制备样品，在“2.1”项色谱条件下进样，记录色谱图。以阿魏酸的保留时间和峰面积为参照，测得4个特征峰的相对保留时间RSD为0.03%～0.04%，均<0.5%，相对峰面积RSD为0.60%～1.77%，均<3.0%，表明该方法重复性良好。

2.9 参照峰选择

阿魏酸是当归中有机酸类成分，含量较多且较稳定，且在提取過程中损失小，在HPLC色谱中峰位居中，峰面积稳定，分离度较好，同时为2015年版《中华人民共和国药典》中当归含量测定的指标性成分，故选择阿魏酸作为参照峰。

2.10 样品测定结果

2.10.1 当归药材特征图谱建立及相似度评价

将15批当归药材按“2.4”项下制备样品，在“2.1”项色谱条件下进样，记录45 min色谱图。将15批当归药材图谱数据导入相似度评价软件（2012版《中药指纹图谱相似度评价系统》），选择S9当归药材样品图谱作为参照图谱，采用多点校正、平均数法，设置时间窗为0.1，生成当归药材特征图谱叠加图谱和对照图谱。见图1、图2。

各供试品溶液色谱图中，各特征峰相对于阿魏酸色谱峰的相对保留时间值见表3，各特征峰相对保留时间的RSD均<0.5%，各特征峰相对于阿魏酸色谱峰的相对峰面积值差异较大。见表4，各特征峰相对峰面积的RSD均>10%，未列于表中。

将15批当归药材样品的色谱图导入相似度评价软件（2012版《中药指纹图谱相似度评价系统》），对生成的当归药材特征图谱进行相似度分析。结果显示15批当归药材的相似度范围为0.967～0.999，表明当归药材的特征图谱较为稳定，通过相似度可以较为整体的评价当归药材质量。相似度结果见表5。

2.10.2 当归身饮片特征图谱建立及相似度评价

取15批当归药材，按“2.3”项下制备方法制备15批当归身饮片，并按“2.4”项下制备15批当归身饮片样品，在“2.1”项下色谱条件下进样，记录45 min色谱图。将15批当归身饮片图谱数据导入相似度评价软件（2012版《中药指纹图谱相似度评价系统》），选择S9当归身饮片样品图谱作为参照图谱，采用多点校正、平均数法，设置时间窗为0.1，生成当归身饮片特征图谱叠加图谱和对照图谱。见图3、图4。

各供试品溶液色谱图中，各特征峰相对于阿魏酸色谱峰的相对保留时间值见表6。各特征峰相对保留时间的RSD均<0.5%，各特征峰相对于阿魏酸色谱峰的相对峰面积值差异较大。见表7。各特征峰相对峰面积的RSD均>10%，未列于表中。

将15批当归身饮片样品的色谱图导入相似度评价软件（2012版《中药指纹图谱相似度评价系统》），对生成的当归身饮片特征图谱进行相似度分析。结果显示15批当归身饮片的相似度0.973～0.999，表明当归身饮片的特征图谱较为稳定，通过相似度可以较为整体的评价当归身饮片质量。相似度结果见表8。

3 讨论

3.1 色谱条件针对当归的有效成分主要为有机酸类和挥发油类，本研究考察了乙腈-磷酸、乙腈-甲酸和乙腈-乙酸3种不同色谱系统，分别进行梯度洗脱，根据色谱峰的分离情况及色谱峰形比较，流动相为乙腈-乙酸时分离度较好，峰形对称，故选之;分别考察0.05%、0.10%、0.15%、0.20%浓度乙酸，结果显示乙酸浓度为0.20%时，色谱峰的峰形较好。本研究采用PDA检测器，对检测波长进行选择，本研究选定的4个特征峰中，藁本内酯、洋川芎内酯I和洋川芎内酯H最大吸收波长均在280 nm附近，

且阿魏酸在280 nm波长下也有良好的相应，图谱较美观，基线平稳，故检测波长定为280 nm。

3.2 样品制备提取溶剂方面，分别考察了纯水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和100%乙醇9种不同提取溶剂，结果显示以70%甲醇、70%乙醇作为提取溶剂时，样品特征峰的峰面积较大;70%乙醇与70%甲醇比较，70%乙醇的提取结果较为稳定，且乙醇毒性较小，故最终选择70%乙醇作为提取溶剂。提取方式方面，以70%乙醇为提取溶剂，分别考察超声与回流的提取效果，结果显示样品超声提取时，各特

征峰的峰面积显著高于回流提取，且超声提取更易于操作，故提取方式选择超声;分别比较超声提取15 min、30 min、45 min和60 min的区别，结果显示，随着超声时间的增加，样品中各成分含量亦逐渐增加，且在30 min时，各成分峰面积已达45 min时各成分峰面积的98%，考虑到节省时间，故本研究选择超声时间为30 min。

3.3 当归药材及当归身饮片特征图谱比较分析当归药材与当归身饮片特征图谱相似，均指认出阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H和藁本内酯4个特征峰。通过比较当归药材与当归身饮片特征图谱，当归身饮片中化学成分含量除藁本内酯外，阿魏酸、洋川芎内酯I和洋川芎内酯H含量均低于对应当归药材中各成分含量，主要原因是当归不同部位所含有的化学成分含量不同[10-12]。其次，在制备当归身饮片时也有少许的化学成分损失[13]。当归药材使用的是全当归，当归身饮片为全当归去除归头与归尾，秦书芝等[14]对当归不同部位中的阿魏酸进行含量测定，研究结果表明，当归中阿魏酸含量最高部位是当归尾，当归头次之，归身含量最低，与本实验中当归身饮片阿魏酸含量低于当归药材中阿魏酸含量的结果一致;藁本内酯为当归中挥发油类的主要成分，在当归中含量较高，在对当归不同部位挥发油研究的文献中发现，当归身中藁本内酯的相对百分含量显著高于当归头和当归尾[15]，当归身饮片中藁本内酯含量高于全当归药材中藁本内酯含量，与本实验结果一致。

本研究建立了当归药材及当归身饮片HPLC特征图谱，并指认出4个特征峰。该方法稳定可靠，重现性好，且简单易操作，能够较为整体全面反映当归药材及当归身饮片的化学成分信息，能够为当归药材及当归身饮片的质量标准提供参考，为含当归或当归身的经典名方的开发研究提供依据。

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