左归饮“异病同治”早发性卵巢功能不全、闭经、绝经综合征的网络药理学研究①

陈 衎,唐金艳,马晓蓉,韩 璐

（1新疆医科大学第四临床医学院,乌鲁木齐 830011；2新疆医科大学第四附属医院妇科,乌鲁木齐 830000）

左归饮由熟地黄、枸杞子、山萸肉、山药、茯苓、炙甘草6味组成，为纯甘壮水之剂，主治真阴不足所致诸症，临床上妇科常用其治疗早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency，POI)、绝经综合征（Menopause syndrome，MPS)和闭经(Amenorrhea)等[1]。中医“异病同治”是中医基础理论的重要组成部分之一，是指不同疾病在其发生、发展过程中出现相同病机，故着眼于这一病机，对不同的疾病，采取同一方法治疗[2]。由于POI、MPS、闭经患者均存在肾阴虚证，具有补阴填精功效的左归饮在“异病同治”理论基础上具有一定依据[3]，但其“异病同治”的具体作用机制尚不明确。网络药理学是基于网络数据库进行数据挖掘及分析的一种方法，基于现代生物信息技术，通过对药物、活性成分、作用靶点、疾病间的相互关系，发掘及阐述中药治疗相关疾病的潜在作用机制，从客观角度帮助我们进行中医药的研究[4]。本研究采用网络药理学方法，基于中医“异病同治”的理念，探究左归饮“异病同治”的作用机制，现报道如下。

1 方法

1.1 左归饮活性成分及靶点蛋白的预测利用TC⁃MSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）数据库，分别搜索熟地黄、枸杞子、山萸肉、山药、茯苓、炙甘草的主要化学成分，对比药物动力学参数（ADME），将其标准设定为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，初步挑选左归饮的潜在药物活性化合物，选取具有明确作用靶点的活性成分作为左归饮候选活性化合物，提取蛋白质靶点，并通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）规范靶点蛋白名称。

1.2 疾病相关靶点的预测在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中 以“Premature ovarian insufficiency”、“Menopause syndrome”、“Amenorrhea”分别检索POI、MPS、闭经3种疾病的相关靶点基因，获得POI、MPS、闭经3种疾病的治疗靶点。

1.3 左归饮及疾病的共有靶点构建为明确左归饮活性成分靶点与POI、MPS、闭经疾病靶点间的紧密关系，将已获得的左归饮活性成分靶点与3种疾病的作用靶点经由Venn在线工具（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分别取其交集，绘制韦恩图，获得四者交集靶点及左归饮治疗各病的交集靶点，将四者交集靶点作为左归饮“异病同治”的共同作用靶点。

1.4 构建左归饮与疾病交集基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络将“异病同治”靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org），取最小相互作用阈值“Highest confidence＞0.9”，并隐藏游离点，并通过Cy⁃toscape3.7.0软件进行PPI网络图的构建。

1.5 “异病同治”靶点的富集分析为阐明左归饮治疗POI、MPS、闭经3种疾病靶点所涉及的细胞组分（CC）、分子功能（MF）、生物过程（BP）和信号通路中的作用，利用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），将左归饮“异病同治”靶点进行GO分析和KEGG分析，将GO及KEGG分析结果的P值由小到大排序（P值越小表明富集结果显著性越高）,并将分析结果排名前十的GO条目通过微生信在线作图平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化展示。

1.6 构建左归饮“异病同治”活性成分-靶点-关键通路网络图将左归饮“异病同治”靶点经KEGG通路富集分析后的前15条关键通路与左归饮的活性成分、作用靶点相对应，通过Cytoscape3.7.0软件构建相关网络图，直观地展现左归饮对这3种疾病的“异病同治”网络关系，预测出该网络中的核心基因，阐述左归饮治疗POI、MPS、闭经的潜在作用机制。

2 结果

2.1 左归饮有效活性成分及作用靶点蛋白的筛选结果通过TCMSP数据库检索获得熟地黄活性成分2个，山药活性成分16个、枸杞子活性成分45个、甘草92个、茯苓15个、山茱萸20个，合并去重并删除无明确靶点的活性成分后获得左归饮活性成分127个，见表1。通过TCMSP查询127个活性成分作用的靶点信息，合并去重后最终预测出左归饮的相关靶点262个。

表1 左归饮组成药物共有的活性物质

2.2 疾病靶点的收集结果通过GeneCards数据库分别检索POI、MPS、闭经的相关疾病基因，得到POI靶点基因4 873个，MPS靶点基因3 408个，闭经靶点基因1 412个，将其与左归饮化合物对应靶点取交集，获得左归饮治疗POI靶点205个，治疗MPS靶点基因178个，治疗闭经靶点基因70个，将左归饮治疗三者的治疗靶点取交集，获得左归饮“异病同治”共有靶点66个，见图1。

图1 左归饮治疗POI、MPS、闭经韦恩图

2.3 PPI网络的构建及分析结果将左归饮“异病同治”靶点经STRING数据库获取PPI网络图，隐藏游离点后得到共有靶点59个。通过Cytoscape3.7.0软件绘制PPI网络图，该网络图含节点59个，节点度值越高，颜色越蓝，图像越大，经软件分析可得平均节点度值为6.203，选取节点度值最多的前20个靶点基因作为左归饮“异病同治”的核心候选基因，并基于STRING数据库选取左归饮治疗POI、MPS、闭经的节点度值排名前20的靶点基因作为左归饮治疗3种疾病的核心候选基因，见表2。

图2 左归饮“异病同治”基因PPI网络图

左归饮“异病同治”核心靶点有TP53、STAT3、TNF、AKT1、IL6等，其中左归饮治疗闭经与左归饮“异病同治”基因的前二十完全相符，说明左归饮治疗POI、MPS基因几乎包含左归饮治疗闭经的靶点基因，提示POI、MPS与闭经之间在病因、症状、治疗上具有一定的趋同性，并为闭经是POI、MPS伴随症状提供一定支持，且“异病同治”排名靠前的基因：AKT1、TP53、IL6在左归饮治疗POI疾病靶点中分别位于第1位、第4位、第2位，在左归饮治疗MPS疾病靶点中分别位于第1位、第3位、第2位，说明左归饮发挥“异病同治”主要功效的核心基因为TP53、AKT1和IL6，且左归饮治疗POI、MPS的核心基因数相同的有19个，其节点度值排名大致相同，提示左归饮治疗POI与MPS的作用靶点大致相同，两者在疾病病因、临床治疗趋同性高，这也与指南所说明的两者在疾病病因、临床表现、治疗方法上的相对一致性相符，见表2。

表2 左归饮治疗POI、MPS、闭经靶点及“异病同治”靶点的预测结果（排名前20靶点基因）

2.4 “异病同治”靶点的GO分析左归饮“异病同治”的GO富集分析涉及相关条目525个，其中BP 413个，CC 45个，MF 67个，选取各自富集程度前10的相关条目，左归饮“异病同治”GO富集分析主要涉及药物反应、基因表达的正调控、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、细胞缺氧反应、相同蛋白质结合、酶结合、类固醇受体活性等，其反应主要集中在细胞外液，见表3。对所选GO分析绘制柱形图，GO分析图横坐标分别为GO-BP、GO-CC，GO-MF排名前10条目，纵坐标为该对应条目对应的P值，条形图越高说明P值越小，富集程度越高，见图3。

表3 GO富集分析BP、CC、MF前10条目

图3 左归饮“异病同治”靶点GO分析图

2.5 “异病同治”靶点的KEGG分析通过DAVID数据库对左归饮“异病同治”靶点进行KEGG分析，导出分析结果，从而得到86条KEGG信号通路，将其中P值最小的前15条信号通路作为左归饮“异病同治”的主要信号通路，见表4。制作富集气泡图，图中P值代表该信号通路的富集程度，P值越小，则富集程度越大，颜色越红，反之P值越大则富集程度越小，颜色越绿。气泡的大小代表所富集的基因个数。参与左归饮“异病同治”治疗作用的信号通路主要有HIF-1信号通路、乙型肝炎（Hepatitis B）信号通路、FoxO信号通路、癌症（Cancer）信号通路等。由此可见，左归饮是通过多靶点，多通路来进行“异病同治”效果，见图4。

2.6 左归饮“异病同治”活性成分-靶点-信号通路网络图构建结果将前面得到的左归饮“异病同治”活性成分、潜在作用靶点及KEGG筛选出来的前15条信号通路一一对应，制作左归饮“异病同治”活性成分-靶点-信号通路图，左归饮“异病同治”通过多种活性成分作用于多个靶点，经不同信号通路发挥治疗作用。主要活性成分包含槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、柚皮素（MOL004328）、刺芒柄花素（MOL000392）、甘草查尔酮A（MOL000497）、薯蓣皂素（MOL000546）等，故推测这些物质是左归饮“异病同治”作用的主要活性成分。主要靶点为TP53、STAT3、TNF、AKT1、IL6等，涉及的主要信号通路有HIF-1信号通路、Hepatitis B信号通路、Cancer信号通路、FoxO信号通路等，见图5。

表4 KEGG富集分析前15信号通路

图4 KEGG富集分析前15信号通路富集气泡图

图5 左归饮“异病同治”活性成分-靶点-信号通路网络图

3 讨论

POI、闭经、MPS都是妇科常见且难治的内分泌疾病，严重影响了女性的生活质量及身心健康，且病因都涉及到肾虚[5-7]，症状及治疗方式也相互交叉[8-10]。POI患者症状与MPS症状大致相同，都有因雌激素下降所导致的月经异常、潮热盗汗、骨质疏松等表现，而POI患者后期会导致闭经的发生，且MPS终末期也会有闭经的症状，而长时间的闭经也会增加POI的发病率，同时也是MPS的最终转归。三者的关系不仅穿插于女性整个生命周期，并与卵巢功能失衡有关，且在病因病机、伴随并发症、治疗方案等层面有着一定的趋同性[11-12]。左归丸是中医经典的补阴填精方剂，临床上常作为基础方治疗肾阴虚证，具有调节卵巢功能、抗氧化、调节免疫、延缓衰老等作用[13]。中医从整体出发，予以辨证论治，是以“异病同治”之基础，且中药通过君臣佐使相互配伍，从多靶点、多信号通路实现药物之间的协同治疗作用，是其“异病同治”之手段。由于中药之间“异病同治”的具体作用机制尚不明确，故采用基于现代生物技术的数据挖掘方法-网络药理学，来发现药物、活性成分、作用靶点、疾病间的相互关系，来进一步挖掘及阐述中药及中药复方治疗相关疾病的潜在作用机制。

本研究通过对左归饮活性物质的筛选，共筛选出其活性成分127个，主要为类固醇化合物：槲皮素、山柰酚、柚皮素、刺芒柄花素、甘草查尔酮A,薯蓣皂素等，此类化合物对卵巢功能具有一定调节作用，可以一定程度治疗POI、MPS和闭经[14-16]。相关研究发现，中药所含类固醇化合物具有拟雌激素样作用，通过外源性补充此类药物，可以缓解机体低雌激素状态，调节内分泌功能，维持肾-天癸-冲任-胞宫轴功能的平衡，缓解卵巢衰老，从而促进卵巢功能的恢复[17]，并干预机体骨质代谢，对治疗雌激素过低导致的骨质疏松有一定的作用[18]，这也与西医HRT治疗因激素紊乱或缺乏所致POI、MPS、闭经有着一定的趋同性，并可缓解因激素紊乱或缺乏所导致的如生殖器萎缩[19]、心脑血管疾病[20]、阿尔兹海默病[21]等一系列并发症。上述活性成分共涉及相关靶点262个，主要有TP53、AKT1、STAT3、TNF、IL6等，目前已有相关研究发现，TP53、AKT1、STAT3、TNF、IL6等靶点参与细胞生长的调控[22-25]，其正常表达时可调节卵巢颗粒细胞的增值分化，维持卵巢正常生理功能，为各级卵泡生长发育提供合适环境，延缓卵巢衰老过程，当其异常表达时，会引起局部氧化应激异常，诱导颗粒细胞自噬及凋亡，引起卵泡闭锁，导致卵巢功能受损，加速其衰老进程，导致卵巢的病理性改变，从而造成POI[26-27]，或造成MPS的提前发生[28]，引起闭经，同时，也对骨质疏松疾病的发生有着直接关系[29]。故此，我们可以猜测左归饮是通过调节以上靶点起到“异病同治”的作用。

经KEGG信号通路分析富集到左归饮“异病同治”涉及的信号通路主要有HIF-1信号通路、Hepati⁃tis B信号通路、FoxO信号通路、Cancer信号通路等，其中HIF-1信号通路、Fox O信号通路在POI、MPS、闭经三病的研究中均有报道，且与三者发生机制、治疗作用研究联系紧密。HIF-1是组织细胞缺氧状态下广泛存在的一种转录因子,在机体氧化应激过程中起着关键作用。HIF-1信号通路可以特异性表达于卵巢颗粒细胞，且与雌激素受体的表达呈正相关，而雌激素受体主要存在于卵囊泡膜细胞，这表明HIF-1信号通路可能直接作用于卵巢[30]，并通过纠正局部组织缺氧状态，改善局部氧化应激水平，减少卵泡闭锁，促进卵泡的发育及黄体功能的调节[31]，维持卵巢功能，防止卵巢早衰[32]，并参与骨质疏松发病过程，抑制其过度表达可以降低相关骨代谢水平，缓解POI、MPS伴随的骨质疏松症状[33]，同时，可以降低FSH水平，提高E2含量，恢复各级卵泡数[34]，在一定程度上改善POI、MPS伴随的月经紊乱及闭经。Fox O是PI3K-AKT信号通路下游靶点之一，参与卵巢颗粒细胞增值、生长分化、凋亡衰老等一系列生命过程的调控，并与女性生殖功能及月经相关密切[35]。有研究发现，当PI3K-AKT信号通路过度激活时，会引起Fox O的异常表达，使其丧失转录活性，导致各级卵泡减少和卵巢萎缩，引发POI[36]。当Fox O正常表达时，可以有效缓解雌激素过低导致的骨质疏松症状[37]，并能调节月经，对POI、MPS、闭经三病具有一定程度上的治疗效果。

本文着眼于中医“异病同治”相关理论，基于网络药理学相关方法，将现代生物学信息技术与传统中医药理论相结合，直观体现了左归饮“异病同治”作用是通过多成分、多靶点的方式发挥其功效，初步探讨了寿左归饮“异病同治”的复杂作用机制。该研究发现，左归饮主要通过提高机体抗氧化能力，抑制细胞凋亡等发挥“异病同治”作用，并激发与卵巢发育有关相关蛋白的表达，发挥拟雌激素样作用，刺激原始卵泡和卵母细胞的生长发育，从而延缓卵巢衰老，维持其正常生理功能，从而对POI、MPS及闭经起到一定治疗作用。虽然本研究为左归饮“异病同治”提供了一定的方向及数据支持，但缺乏相关研究，对于各靶点、信号通路之间关系的阐述不够充分。由于网络药理学有其缺陷所在，以此所预测的核心靶点主要集中在枸杞子、甘草中，并未集中在君药熟地，可能与网络药理学应用指标选取及相关数据库长期未更新有关，且中药复方之间化学成分的复杂作用机制尚不明确，故此研究具有一定的局限性，需要学者们进一步的研究发现。