展示犬瘟热病毒抗原表位的犬细小病毒样颗粒构建

窦小龙，马文戈，苗书魁，米晓云 ，盛肖刚 ，魏玉荣 *

（1青岛拜特尔生物科技有限公司，山东 青岛 266114）

（2新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830013）

（3新疆动物疫病研究重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830013）

（4新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐 830011）

犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）感染引起的犬瘟热是一种急性、亚急性、高度接触性传染病，犬和肉食目中许多动物都可感染。犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬非化脓性心肌炎的重要病原，可促进肠道细菌易位，并引起严重的免疫抑制[1]。临床上两种病常常并发或继发感染，危害严重[2]。目前，对CDV及CPV防控主要是以弱毒疫苗免疫预防为主，虽然广泛应用的弱毒联苗具有保护力强等优点，但弱毒苗在使用过程中也存在弱毒株毒力返祖、与野毒基因重组加速病毒变异、对某些敏感性动物依然致病等诸多问题，需要开发新型疫苗来弥补这些不足。病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）可模拟病毒自身特有的结构但不能自我复制，确保了免疫原的安全性及免疫原性，具有良好开发前景[3-5]。

核衣壳蛋白VP2是CPV的主要保护性抗原[6]，在体外表达后可以自我装配成VLPs[7]。已有研究证明VP2蛋白上某些氨基酸片段缺失或替代并不影响其在体外组装成VLPs[8]，这使得VP2蛋白可作为外源抗原的载体形成VLPs制备多价抗原。CDV融合蛋白（F）是构成病毒囊膜的主要成分，在病毒感染和致病性方面起着重要作用。麻疹病毒属成员中CDV、麻疹病毒（measles virus,MV）和牛瘟病毒（rinderpest virus,PRV）群特异性表位主要在F蛋白上，是异型免疫的主要交叉抗原[9]。F蛋白的400-LSEVKGVIVHRLEAVS-415基序是重要的T细胞表位，能诱导CTL活性，516-INQSPDKLLTF-526基序是B细胞抗原表位。基于T细胞表位和B细胞表位的合成肽免疫小鼠后能对MV、CDV的攻击产生明显的保护反应[10]。本实验将CDV F蛋白的B细胞表位插入CPV VP2的氨基端，并用CDV F蛋白的T细胞表位替换CPV VP2蛋白loop 2区域的218-LIPSHTGTS⁃GTPTNIY-233氨基酸序列，人工合成编码该融合蛋白的核苷酸序列，并克隆到pET-28a（+）载体上，转化BL21(DE3)，表达的重组蛋白能组装成VLPs，且具有良好的免疫原性。本实验为重组CDV和CPV新型亚单位疫苗的研究提供了新的探索途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞、表达载体及实验动物

感受态JM109、BL21（DE3）及表达载体pET-28a（+）均由新疆畜牧科学院兽医研究所病毒研究室保存。BALB/c小鼠购自新疆医科大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶BamH I、XhoI，T4 DNA Poly⁃merase，Prestained Protein Ladder购自 Thermo Fisher Scientific；DL15 000DNA Marker购自TakaRa；质粒小提试剂盒（Plasmid Miniprep Kit）购自爱思进生物技术（杭州有限公司）；兔抗犬IgG（Anti-Dog IgG-Perox⁃idase antibody produced in rabbit）购自SIGMA。206佐剂由新疆畜牧科学院兽医研究所病毒研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 FB-FT-VP2基因合成及表达质粒的构建

参考CPV VP2蛋白（GenBank ID：ACS50333.1）和CDV F蛋白（GenBank ID：AAK54668.1）序列，选择CDV F蛋白的B细胞表位516-INQSPDKLLTF-526氨基酸序列融合到CPV VP2蛋白的氨基端，并用CDV F蛋白上的T细胞表位400-LSEVKGVIVHRLEAVS-415氨基酸序列替换CPV VP2蛋白loop 2区域的218-LIPSHTGTS GTPTNIY-233氨基酸序列，融合蛋白氨基酸序列如图1。委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成编码该融合蛋白的核苷酸序列，并克隆到pET-28a（+）载体上，命名为pET-28a-FBFT-VP2。

图1 FB-FT-VP2融合蛋白氨基酸序列

1.2.2 融合蛋白的表达

重组质粒pET-28a-FB-FT-VP2经酶切、测序鉴定正确后转化BL21（DE3）感受态细胞，涂布含50 μg/mL硫酸卡那霉素LB平板，筛选阳性克隆菌株命名为BL21-pET-28a-FB-FT-VP2。接种含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养至OD600nm为0.6～0.8。加入100 mmol/L的IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃再培养3 h。

1.2.3 融合蛋白SDS-PAGE及Western-blot检测

取200 μL菌液12 000 r/min离心5 min，沉淀用10 μL PBS重悬，加入2×SDS上样缓冲液10 μL，经沸水浴处理10 min后取10 μL进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。Western-blot检测时脱脂乳封闭1 h。一抗是CPV阳性血清，37℃孵育1 h。PBS洗涤后加辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG为二抗，37℃孵育1 h。PBS洗涤后用DAB显色液显色。

1.2.4 融合蛋白的包涵体变性、复性及内毒素去除

菌体超声破碎、离心取沉淀，加入沉淀重量10倍体积含1% Triton X-114的20 mmol Tris-HCl（pH7.4）缓冲液充分悬浮，室温静止5 min，12 000 r/min离心5 min，收集沉淀。重复2～3次以充分去除内毒素。按每克原菌体湿重加入6 mol/L尿素溶液2 mL重悬，室温下作用1 h变性。将变性蛋白液缓缓加入10倍体积的20 mmol Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中，混匀后4℃静止过夜。12 000 r/min离心5 min收取上清即为复性的FB-FT-VP2融合蛋白。

1.2.5 重组VLPs的透射电镜检测

取 FB-FT-VP2融合蛋白液 1 mL，加入 10 μL CPV阳性血清，37℃作用30 min，迅速放置4℃平衡1 h。4℃条件下12 000 r/min离心30 min，弃上清液900 μL，留100 μL上清溶解沉淀作为电镜样品，4 ℃条件下送新疆大学理化测试中心电镜室，醋酸铀负染色，于H-600透射电镜下观察VLPs组装情况。

1.2.6 融合蛋白的血凝效价测定

96孔微量板从第1孔至12孔，每孔加PBS 25 μL。FB-FT-VP2融合蛋白液25 μL，从第1孔起，依次做2倍系列稀释，至最后1个孔，弃去25 μL液体。每孔加入0.5%豚鼠红细胞悬液25 μL，并设不加样品的红细胞对照孔，在微量板振荡器上摇匀，置室温1 h，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

1.2.7 融合蛋白免疫效果检测

1.2.7.1 亚单位疫苗配制

取FB-FT-VP2融合蛋白液用生理盐水稀释至蛋白浓度为200 μg/mL，与206佐剂1∶1混合乳化。

1.2.7.2 BALB/c小鼠免疫

7周龄雌性BALB/c小鼠随机分成2组，每组10只，第一组为试验组，腹腔注射FB-FT-VP2亚单位疫苗0.1 mL/只（10 μg FB-FT-VP2蛋白），第二组为对照组注射生理盐水0.1 mL/只。免疫后第21天小鼠尾静脉采血分离血清。

1.2.7.3 CDV中和抗体检测

将免疫小鼠血清用不含牛血清的细胞维持液从1∶16作倍比稀释至1∶128，取 4个稀释度分别与200 TCID50/0.1 mL的CDV毒液等量混合，另取200 TCID50/0.1 mL的病毒液加入等体积细胞维持液作为病毒对照，置37℃作用1 h，接种Vero细胞单层96孔培养板，每个稀释度8孔，每孔0.1 mL，同时设对照细胞8孔（只加维持液）。接种后，置5%二氧化碳、37℃条件下培养5 d，观察CPE，病毒对照细胞孔均应出现CPE，细胞对照孔无CPE，按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价。

1.2.7.4 CPV中和抗体检测

小鼠免疫血清CPV中和抗体检测方法同

1.2.7.3，所用细胞为F81。

2 结果

2.1 FB-FT-VP2基因合成及表达质粒的鉴定

合成FB-FT-VP2基因共1 788 bp，并将该片段克隆到pET-28a（+）载体上构建pET-28a-FB-FTVP2质粒，经BamHI、XhoI双酶切鉴定，酶切得到的目的片段为1 788 bp，见图2。

图2 pET-28a-FB-FT-VP2的酶切鉴定

2.2 融合蛋白的表达

以BL21（DE3）未转化菌体蛋白做阴性对照，SDS-PAGE电泳，Western-blot检测pET-28a-FBFT-VP2转化菌表达融合蛋白情况。考马斯亮蓝染色，在66 KDa左右出现特异性条带，见图3。用CPV阳性血清作一抗，用辣根过氧化物酶标记的兔抗犬抗体作二抗对表达产物进行Western-blot，经DAB显色液显色，在66 KDa左右出现特异性条带，见图4。结果表明FB-FT-VP2融合蛋白与CPV阳性血清可特异性结合。

图3 FB-FT-VP2融合蛋白的SDS-PAGE检测

图4 FB-FT-VP2融合蛋白的Western-blot检测

2.3 VLP的透射电镜检测

透射电镜检测显示，能观察到直径约22 nm大小的VLPs，见图5。

2.4 融合蛋白的血凝效价测定

FB-FT-VP2融合蛋白液对0.5%豚鼠红细胞悬液的凝集价为1∶1 024，对照孔中的红细胞无血凝，呈显著纽扣状，见图6。

图6 FB-FT-VP2融合蛋白的血凝效价测定

2.5 融合蛋白免疫效果检测

7周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射FB-FT-VP2亚单位疫苗0.1 mL/只（10 μg FB-FT-VP2蛋白），免疫后第21天尾静脉采血分离血清。免疫组CDV中和抗体 1∶32（4/10）至 1∶64（6/10）；CPV 中和抗体 1∶64（10/10）。对照组均未检测到中和抗体。免疫小鼠血清中和后病毒接种细胞与细胞对照相比，细胞无明显变化，形态基本完整；接种病毒的细胞病变明显，成团、聚集或脱落。可见免疫小鼠血清中含有效中和抗体，见图7。

图7 免疫小鼠血清病毒中和实验

3 讨论

利用VLPs展示外源病原的抗原表位，将外源表位正确折叠且充分暴露于VLPs表面更易于表位与B细胞受体结合，从而诱导高滴度的抗体水平。由于组装的VLPs能模拟病毒结构，可使VLPs疫苗达到与全病毒相近的免疫效果。CPV疫苗能刺激有效的免疫保护[11-12]。随着CPV衣壳结构的解析，基于VP2蛋白亚单位疫苗的研究不断深入。研究者在CPV VLPs制备方面进行了大量研究，借助原核、真核、杆状病毒及家蚕表达系统表达的CPV的VP2蛋白均可以自组装成VLPs，重组的VP2 VLPs疫苗，能够刺激较高的抗体滴度从而保护试验动物抵抗CPV病毒攻击[13-16]。CPV VP2蛋白组装成的VLPs能模拟完整蛋白结构，比单独的表位疫苗免疫原性好，能够诱导高水平的体液免疫和细胞免疫。探索在不破坏VP2上自身抗原表位的同时将外源表位正确展示在VLPs表面的多价抗原，免疫动物可以获得同时抵御CPV及外源病原攻击的保护，可达到一针多防的效果。

本实验将CDV F蛋白的B细胞表位插入CPV VP2的氨基端，用CDV F蛋白的T细胞表位替换CPV VP2蛋白loop 2区域的218-LIPSHTGTSGTPTNIY-233氨基酸序列，人工合成编码该融合蛋白的核苷酸序列，并克隆到pET-28a（+）载体上，转化BL21(DE3)感受态，成功表达了FB-FT-VP2融合蛋白。表达的重组蛋白纯化后能体外组装成VLPs，透射电镜可以观测到约22 nm大小VLPs结构，与天然的CPV粒子大小接近。FB-FT-VP2融合蛋白组成的VLPs具有与天然CPV粒子相似的血凝特性。Western-blot结果证实，该重组融合蛋白具有良好的反应原性。免疫BALB/c小鼠能刺激产生针对于CPV和CDV的中和抗体。本实验为重组CDV和CPV新型亚单位疫苗的研究提供了新的探索途径，为犬的多价亚单位疫苗研究奠定了一定的基础。

4 结论

大肠杆菌表达系统表达的含CDVF基因B、T细胞抗原表位重组CPV VP2蛋白可自我组装成VLPs，并具有血凝活性，可产生刺激机体中和抗体。基于体外中和实验，构建的双价疫苗有望可同时预防犬细小病毒病和犬瘟热。