‘绿宝石’梨果实发育期酚类物质的动态变化及其抗氧化活性

王鑫，姜喜，于军,2，蒲云峰，林彩霞，吴翠云,2*

(1塔里木大学植物科学学院/南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室，新疆 阿拉尔 843300)

(2塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

(3塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

(4新疆生产建设兵团第二师农业科学研究所，新疆 铁门关 841005)

酚类物质是植物的主要次生代谢产物之一，参与植物的生长繁殖过程，协助植物抗逆，抵抗天敌侵害[1]。酚类物质对人体也有着一定的营养价值[2]，在防病保健方面，具有抗肿瘤、抗氧化、防治心脑血管疾病以及抗菌等作用[3]。

近年来，对水果内酚类物质的研究已成为热点。对梨果实内酚类物质的研究已有相关的报道，研究表明，梨果实中主要包括羟基肉桂酸、羟基醌、黄烷醇、黄酮醇等酚类物质；其中绿原酸、熊果苷、儿茶素、表儿茶素、芦丁是梨中主要的酚类单体化合物[4]。LONG Z等[5]在梨皮中鉴定出36种黄酮和19种羟基肉桂酸酯，主要酚类物质是熊果苷和绿原酸，其余酚类物质品种间差别很大。不同品种梨果实中酚类物质含量也有差别。曾少敏等[6]研究发现不同梨系统间总酚、总黄酮含量存在显著差异，表现为秋子梨最高，西洋梨略低，新疆梨、白梨次之，砂梨最低。梨果实中酚类物质及含量的分布也有一定的规律。李静等[7]、张小双等[8]研究表明：梨果实中果皮部位酚类物质含量最高，果心次之，果肉中最低。李凡等[9]对梨中主要的酚类物质熊果苷在果实中的含量与分布进行研究，结果表明5个品种中的含量均为果皮＞果心＞果肉；其中果肉中的熊果苷分布也表现出靠近果皮和果心的含量大于中部的含量。安景舒等[10]、郭杰[11]、曾少敏等[6]的研究中均表明梨果实中酚类物质均具有一定的抗氧化活性，且不同品种间的抗氧化活性有所不同。‘绿宝石’梨又名‘中梨一号’为优良早熟新品种，口感细腻脆爽，丰产，连续结实能力强，具有较好的经济价值[12]。本试验以‘绿宝石’梨果实为试材，采用超声波辅助甲醇提取法及自由基清除法对果实发育期内总酚、总黄酮、酚类组分含量和抗氧化能力的动态变化进行检测，旨在揭示‘绿宝石’梨果实发育过程中酚类物质及抗氧化能力变化规律，为梨的功能性物质研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘绿宝石’梨果实样品采自轮台梨种质资源圃，于2019年5月25日（花后50 d）开始采样，每隔14 d采样一次，采摘时随机选取树冠外围、中部不同方向，无病虫害，大小一致的果实，每棵树10个，三次重复。采后立即放入4℃采样箱中运回，带皮切片去核后保存于-70℃超低温冰箱中待测。

TU-1800型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；1510酶标仪、374酶标仪，美国Thermo Fisher ROTINA 380R；LC-20A液相色谱，日本岛津。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

梨果实样品从超低温冰箱取出后，立即放入温度为-50℃的真空冷冻干燥机中冷冻干燥72 h，得到的冻干样品用组织破碎机粉碎，于-20℃贮藏待测。

1.2.2 酚类物质的提取

精确称取1.000 0 g果实样品冻干粉，用80%的甲醇溶解定容到25 mL容量瓶中，超声波提取30 min后4 500 r/min离心15 min，将离心后的上清液贮藏在-20℃的条件下备用。

1.2.3 主要活性物质的测定

总酚的测定参考Folin-Ciocalteu法[13]，以每g干样所含没食子酸的量表示，单位为mg GAE/g DW。总黄酮的测定采用硝酸铝比色法，以每g干样所含芦丁的量表示，单位为mg RE/g DW。

1.2.4 酚类组分测定

采用高效液相色谱法（HPLC）[13]，色谱条件：C18（250 mm×4.6 mm，5μm）柱，柱温30℃，进样量10 μL，流速1 mL/min，流动相A为0.5%甲醇水溶液，流动相B为乙腈。样品中的酚类物质含量以μg/g DW表示。

1.2.5 抗氧化能力的测定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力参考PU Y等[13]的方法。用6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）作为标准物质，结果以μmol TE/g DW表示。

1.3 数据处理

运用Origin 8.5软件进行数据作图，运用DPS 7.5软件进行 Duncan’s多重比较（P＜0.05）和Pearson相关系数分析。

2 结果与分析

2.1 ‘绿宝石’梨果实发育期总多酚、总黄酮含量的变化

‘绿宝石’梨果实发育期总酚、总黄酮含量变化（如图1、图2所示），在‘绿宝石’梨生长发育期，总酚、总黄酮含量均呈现下降趋势，在花后50～65 d降低的最显著。在花后50 d时，总酚、总黄酮含量最高，分别达18.95 mg GAE/g DW、34.48 mg RE/g DW。随果实的生长总酚、总黄酮含量急剧下降，至花后65 d，果实中的总酚含量下降了70.66%。花后95～140 d果实中总酚含量变化差异不明显，均在3.28～2.11 mg GAE/g DW范围内变化。至果实成熟时，果实内总酚含量最低，为2.11 mg GAE/g DW，仅有花后50 d时的11.13%；果实内总黄酮的含量变化趋势与总酚含量一致，花后50 d时总黄酮含量是成熟时的12.54倍，花后80 d便下降到一个较低的水平，其含量在2.75～5.77 mg RE/g DW之间。

图1 ‘绿宝石’梨果实发育期内总酚含量的变化

图2 ‘绿宝石’梨果实发育期内总黄酮含量变化

2.2 ‘绿宝石’梨果实发育期内酚类物质组分分析

用HPLC法共鉴定出14种酚类物质，分别为熊果苷、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、山萘酚-己糖-双脱氧己糖苷、芦丁、山萘酚-3-O-芸香糖苷、槲皮葡萄糖苷、槲皮素鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山萘酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山萘酚-3-乙酰基葡萄糖苷、异鼠李素-3-乙酰基己糖苷。从表1可以看出，整个生育期中熊果苷的平均含量最高，达4 214.82 μg/g DW，占总组分的55.72%；绿原酸次之，平均含量为1 656.58 μg/g DW，占总组分的28.10%；儿茶素、表儿茶素的平均含量分别为213.62 μg/g DW、188.04 μg/g DW，占总组分的 3.07%、2.95%；其余酚类物质含量较少，含量在5.34～99.41 μg/g DW间，各占比在1%左右。异鼠李素-3-乙酰基己糖苷含仅存在于果实发育初期，在花后95 d之后该物质检测不到。因此熊果苷、绿原酸是‘绿宝石’梨酚类物质的主要组成成分。

表1 ‘绿宝石’梨果实发育期内各酚类组分含量变化 单位：μg/gDW

在‘绿宝石’梨整个生育周期中，酚类物质各组分含量呈现不同的变化趋势，大体可分两种，一种持续下降，直至果实成熟降至最低。此类物质分别为熊果苷、儿茶素、绿原酸和异鼠李素-3-乙酰基己糖苷，其含量均在花后50 d最高，成熟后含量最低。另一种中期降至最低，此类酚类组分均表现出在花后95 d含量最低，此时的含量与成熟时相近甚至低于成熟期。

2.3 ‘绿宝石’梨果实发育过程中体外抗氧化活性的动态变化

‘绿宝石’梨果实在发育过程中抗氧化活性的变化影响如图3所示。在果实发育的过程中，对DPPH、ABTS自由基的清除能力均呈现降低的趋势。在花后50 d‘绿宝石’梨对自由基的清除能力最强；随着果实发育对自由基的清除能力迅速下降。在成熟后对自由基的清除力降至最低。

图3 ‘绿宝石’梨果实发育过程中抗氧化活性的变化

‘绿宝石’梨果实在发育过程中对不同的自由基的清除能力也不同，对DPPH自由基的清除能力低于ABTS。在花后50 d对ABTS的清除能力是DPPH的5.99倍，对ABTS的清除能力可达446.14 μmol TE/g，但对DPPH的清除能力仅有74.47 μmol TE/g。在花后50～65 d是‘绿宝石’梨果实抗氧化性最高的时期。

2.4 ‘绿宝石’梨果实发育期内酚类物质与抗氧化活性相关分析

‘绿宝石’梨果实发育过程中，酚类物质含量与抗氧化性之间的相关性如表2所示。总酚、总黄酮、熊果苷、绿原酸、表儿茶素、山萘酚-己糖-双脱氧己糖苷、槲皮葡萄糖苷、山萘酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-乙酰基己糖苷含量对ABTS、DPPH的清除能力均呈现极显著正相关（P＜0.01），异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量对DPPH的清除能力呈显著正相关(P＜0.05)，儿茶素、槲皮素鼠李糖苷的含量对ABTS的清除能力呈显著正相关(P＜0.05)。芦丁、山萘酚3-乙酰基葡萄糖苷的含量与DPPH、ABTS清除能力无相关性。从相关性分析可以看出总酚和黄酮是‘绿宝石’梨抗氧化活性的物质基础，其中绿原酸在对DPPH自由基的清除中起着较为重要的作用。表儿茶素、槲皮葡萄糖苷是对ABTS自由基的清除中的主要贡献者。

表2 ‘绿宝石’梨果实发育期酚类物质与抗氧化性之间的相关性

3 讨论

酚类物质可以参与植物生殖，协助其抗逆[1]，各类植物在不同的时期表现出不同的积累含量。植物在果实发育前期积累大量的酚类物质有利于幼果抵抗高温、虫害、干旱等胁迫压力，使果实得以成熟，顺利完成繁殖过程[14]。‘绿宝石’梨果实发育过程中主要的酚类物质是熊果苷和绿原酸，这与CUI T等[15]对鸭梨的研究相吻合。酚类物质的含量随着果实的成熟而降低，这与赵金伟等[16]对苹果梨生育期酚类物质变化的研究结果相一致。对于果实中酚类物质含量随着成熟而降低，王思新等[17]认为果重的增加是导致酚类物质下降的主要原因之一；果实内酚类物质的下降也是抗氧化性降低的主要原因。‘绿宝石’梨在果实发育期的抗氧化性同猕猴桃[18]、枣[19]等研究相一致，均表现为在幼果期抗氧化性较高，随着果实成熟而逐渐降低。

黄酮类化合物又称类黄酮、黄酮体等，广泛存在于植物的各个器官中，是其产生的一类次生代谢物[20]。‘绿宝石’梨果实发育的过程中黄酮类物质含量的变化与陈洪强等[21]对葡萄生长发育中类黄酮含量的变化一致；研究表明幼果期和果实成熟后期是黄酮类化合物的主要积累期，果实发育初期果实生长较快，黄酮类化合物伴随着果实细胞大量分裂和强烈的新陈代谢迅速积累；成熟期黄酮类化合物含量低于幼果期，分析原因是细胞内含水量比较高；对于在‘绿宝石’梨果实发育期儿茶素的含量变化与赵金伟等[16]对苹果梨的研究结果有所不同：苹果梨在果实发育期儿茶素的含量呈现出了低-高-低的趋势，即幼果期和成熟期含量较低，发育中期含量增高，而‘绿宝石’梨则表现出持续降低的趋势。目前清除自由基是评价抗氧化能力的基础方法[22]，赵金伟等[23]用熊果苷和绿原酸纯品进行抗氧化能力对照实验，结果表明熊果苷的清除能力低于绿原酸，这与本研究中熊果苷抗氧化性能力相关性低于绿原酸结论吻合。GALVIS A C等[24]的研究结果认为抗氧化性不是由单一的酚类组分决定的，对自由基的清除可能是酚类物质间协同作用的结果。本研究中在抗氧化活性物质也仅考虑了酚类和黄酮类物质对抗氧化活性的影响，对于‘绿宝石’梨的抗氧化作用，还需要进一步进行探究。

4 结论

‘绿宝石’梨在果实发育期内总酚、总黄酮的含量呈下降的趋势，以花后50 d的含量最高，在成熟的过程中前期下降迅速，后期下降缓慢，逐渐趋于平稳。熊果苷、绿原酸是‘绿宝石’梨果实中的主要酚类物质；对于DPPH、ABTS自由基的清除能力也随着果实的成熟呈现下降趋势，在幼果期显著高于成熟期。绿原酸、表儿茶素、槲皮葡萄糖苷是在抗氧化过程中比较重要的酚类组分，‘绿宝石’梨具有很好的抗氧化性。