超高效液相色谱法同时测定紫黄软膏中阿魏酸和小檗碱含量

秦利芬，李惠英，李聃，杨晓峰，代泽友，李瑞芸

(昆明医科大学附属儿童医院，云南昆明 650228)

紫黄软膏由紫草、黄连、黄柏、当归、生地及冰片组成，是昆明医科大学附属儿童医院经60余年临床筛选，应用于儿童尿布疹、湿疹、烧伤、烫伤的外用经验方。多年临床实践证实，紫黄软膏具有疗效确切、不良反应少、使用方便、儿童用药依从性好等优点。目前，紫黄软膏质量标准仍沿用20世纪中期的我院自制简单标准，缺乏定量控制指标，在质量控制方面无关键性检测数据支持，难以保证每批制剂的均一性和稳定性。方中生地黄清热凉血，养阴生津；当归补血，活血通络而不伤血，共为君药。紫草清热凉血，活血解毒，透疹消斑；黄连清热燥湿，泻火解毒；黄柏清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮，共为臣药。冰片通诸窍，散郁火，消肿止痛，防腐生肌为佐药。本方诸药相伍清热凉血、活血、燥湿而不耗血伤阴，为清热解毒、活血通络、消肿止痛、防腐生肌之良方。因此，本研究选取君药当归和臣药黄连与黄柏的主要成分阿魏酸和小檗碱进行含量测定，以期为全面、有效、快速地控制紫黄软膏的质量提供参考[1]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY UPLC(Waters公司，美国)超高效液相色谱仪，分析天平(奥豪斯仪器有限公司CP114)，恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司HH-S6)，集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂HH-S)。

1.2 试药

紫黄软膏(昆明市儿童医院制剂室，20190130、20190214、20190329)，阿魏酸(中国药品生物制品研究院，110773-201614)，盐酸小檗碱(中国药品生物制品研究院，110713-201613)，乙腈(德国MARK公司)为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯，水为娃哈哈纯净水(娃哈哈启力食品有限公司)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，体积流量0.3 mL/min，以乙腈(A)和0.05%磷酸二氢钾(B)为流动相，梯度洗脱程序(0～3 min，18%～18%A；3～4 min，18%～28%A；4～9 min，28%～28%A)，检测波长345 nm[2]，柱温35 ℃，进样量5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液 精密称取紫黄软膏5 g，加水 50 mL，60 ℃水浴加热10 min至融化，磁力搅拌30 min，过滤至蒸发皿中，蒸干，加流动相(A∶B=20∶80)溶解，定容至2 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤备用。

2.2.2 对照品溶液 取盐酸小檗碱和阿魏酸适量加流动相(A∶B=20∶80)制成含盐酸小檗碱2.92 μg/mL、阿魏酸13.76 μg/mL的混合对照品溶液，即得，以0.22 μm的微孔滤膜过滤备用。

2.2.3 阴性对照溶液 按照“2.2.1”供试品溶液的处理方法，不添加紫黄软膏进行处理，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 精密量取供试品、对照品、阴性对照溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果阿魏酸与小檗碱出峰位置阴性对照品溶液无干扰信号出现。见图1、图2、图3。

图1 阴性对照品色谱图

图2 混合对照品色谱图(A阿魏酸，B小檗碱)

图3 供试品色谱图

2.3.2 线性性关系考察 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液1、2、4、6、8、10、12 μL按“2.1”项下色谱条件进样。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并进行线性回归分析。阿魏酸的回归方程为：Y=6×106X+56 720，r=0.999 6，提示阿魏酸在13.76～165.12 μg/mL范围内具有良好的线性关系。小檗碱的回归方程为：Y=8×106X+16 656，r=0.999 8，提示小檗碱在2.92～35.04 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.3.3 精密度实验 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，连续进样6次，结果阿魏酸峰面积积分值RSD=1.19%，小檗碱峰面积积分值RSD=1.96%，表明精密度良好，见表1。

2.3.4 重复性实验 按“2.2.1”项下供试品溶液制备的方法，平行制备6份供试品，精密量取各供试品溶液 5 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样，结果阿魏酸含量 RSD=2.85%，小檗碱含量RSD=2.94%，说明供试品溶液重复性良好，见表2。

表1 阿魏酸和小檗碱精密度测定结果

表2 阿魏酸和小檗碱重复性测定结果

2.3.5 稳定性实验 取重复性实验中的一种供试品溶液按照“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12 h测定，结果阿魏酸峰面积积分值RSD=1.47%，小檗碱峰面积积分值RSD=2.06%，说明供试品溶液在12 h内稳定。提示阿魏酸和小檗碱在12 h内稳定。

2.3.6 加样回收率实验 精密称取5份已知含量的紫黄软膏各2.5 g，每份加入含阿魏酸15.26 μg/mL的对照品溶液0.5 mL，含小檗碱6.66 μg/mL的对照品溶液0.5 mL，按照供试品溶液制备项下操作，采用“2.1”项下的色谱条件测定阿魏酸与小檗碱含量，计算回收率，见表3。

表3 阿魏酸和小檗碱加样回收测定结果

2.3.7 样品含量测定 取3批制剂，按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项下色谱条件进样，计算阿魏酸与小檗碱含量，见表4。

表4 阿魏酸与小檗碱含量测定结果 μg/g

3 讨论

本研究采用超高效液相色谱法(UPLC)建立了紫黄软膏中两种有效成分阿魏酸和小檗碱含量的测定方法，分别对精密度、重复性、稳定性和加样回收率进行了考察，结果均符合要求。对3批样品进行含量测定，结果显示阿魏酸含量2.81～3.05 μg/g，平均2.93 μg/g；小檗碱含量1.01～1.30 μg/g，平均1.21 μg/g。3批样品之间两种成分测定结果差异均较小，可作为紫黄软膏的含量测定指标，用于制剂快检工作。

本研究采用单因素分析考察了浸泡、磁力搅拌、超声提取法对提取效果的影响，发现磁力搅拌提取更完全，故采用磁力搅拌提取法制备供试品溶液。此外，对提取溶剂进行了考察，分别以70%甲醇、甲醇、乙醇、水为溶剂磁力搅拌提取，结果醇提取杂质峰较多，最终选择水为溶剂。

本研究采用单因素分析考察了流动相乙腈-0.05%磷酸二氢钾、甲醇-0.05%磷酸二氢钾、乙腈-0.03%磷酸、甲醇-0.03%磷酸、甲醇-水、乙腈-水[3]，结果显示乙腈-0.05%磷酸二氢钾条件下色谱峰尖锐且呈正态分布，通过梯度洗脱目标物实现了良好分离[4]。色谱柱考察了ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)的影响，结果显示采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，各成分色谱峰峰形、分离度均较好[5]。此外，本研究考察了超高效液相色谱常用柱温(30 ℃、35 ℃及40 ℃)和常用体积流量(0.15 mL/min、0.20 mL/min及0.30 mL/min)的影响，结果显示柱温 35 ℃ 和40 ℃峰型均较好，考虑节能及色谱柱保护，选择柱温35 ℃；体积流量对结果无影响，考虑时间和资源节省，选择体积流量0.30 mL/min。

综上所述，本研究采用UPLC法同时测定我院自主研发制剂紫黄软膏中主要成分阿魏酸和小檗碱的含量，为紫黄软膏的质量标准修订提供全新的含量检测数据，对全面控制紫黄软膏的质量具有十分重要的意义。该方法快捷、简便、准确、可靠，可消耗较少的样本量，在较短时间内获取更多信息，极大地提高了工作效率，可为其他医疗机构研发自制制剂提供参考。