大口黑鲈源维氏气单胞菌的分离鉴定

2021-06-23董浚键刘志刚孙成飞

南方水产科学 2021年3期

杨超，董浚键，刘志刚，孙成飞，赵飞，叶星

（1.上海海洋大学/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室/水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306；2.中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东广州 510380）

大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 隶属鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属，原产于北美洲，于1983年从中国台湾引入广东省。大口黑鲈适温能力较强，生长速度快且易捕捞，肉质较好、无肌间刺，深受消费者欢迎。由于大口黑鲈配合饲料的突破，养殖规模进一步扩大[1-3]。据2020中国渔业统计年鉴，2019年我国养殖大口黑鲈年产量已达47.8万吨[4]。但近年来，我国大口黑鲈育苗期与成鱼养殖期病害频发，尤其是细菌与病毒性疾病使其养殖业遭受了巨大损失。

维氏气单胞菌 (Aeromonas veronii) 隶属弧菌科、气单胞菌属，是重要的人、兽及水生生物共患病原菌[5]。其广泛存在于环境中，尤其是水体环境，夏、秋两季最有利于其增殖，在水生生物个体免疫力低下或体表有创伤的情况下更容易感染该菌，暴发时可造成较高的死亡率[5-7]，如2014年8月四川雅安某水库养殖大口黑鲈出现大面积死亡，死亡率高达60%[5]。已发现该菌感染导致多种水产养殖动物发病，如乌鳢 (Channa argus)、大黄鱼 (Pseudosciaena crocea)、斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)、克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)、虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)、鲫 (Carassius auratus gibelio)、泥鳅 (Misgurnus anguillicaudatu)、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)、青虾 (Macrobrachium nipponense)、锦鲤 (Cyprinus carpio) 和黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 等[8-15]。鱼类感染维氏气单胞菌的典型症状为鱼体溃烂出血，肝脏、脾脏肿大及肾脏充血等。

维氏气单胞菌包括2个生物型，即维氏气单胞菌维罗纳生物型 (A.veroniibv.veronii) 与维氏气单胞菌温和生物型 (A.veroniibv.sobria)[16]。在鱼类中也发现有维氏气单胞菌的不同生物型。在尼罗罗非鱼上发现维氏气单胞菌温和生物型的感染[17]，在乌鳢、尼罗罗非鱼上发现维氏气单胞菌维罗纳生物型感染[6,18]。近年大口黑鲈也有被维氏气单胞菌感染导致暴发性死亡的相关报道，且其苗种和成鱼均可被感染[19-22]，但均未进一步鉴定其具体属于哪个生物型。

为查明引起2020年春季广东省佛山市某育苗场大口黑鲈鱼苗暴发性死亡的病原菌，本研究对采集的大口黑鲈发病样本开展了细菌分离与攻毒、分子与生理生化鉴定和药物敏感性等实验，为大口黑鲈苗种的病害防控及疫苗研制提供了科学依据，也为区分维氏气单胞菌生物型提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

发病大口黑鲈样本采自广东佛山某鲈鱼苗种场，体质量约 (10±2) g。健康大口黑鲈鱼苗由广州爱渔公司提供，体质量约 (20±5) g。用于攻毒实验的健康大口黑鲈鱼苗在攻毒前检测脾肾综合症病毒与蛙病毒携带情况，结果均为阴性。

脑-心浸萃液态培养基 (BHI)、七叶苷、精氨酸双水解酶及无菌液体石蜡均购自广州环凯生物科技有限公司。RS琼脂、羊血琼脂平板购自广州勤卓生物科技有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司。药敏实验所用的抗菌药物购自杭州微生物试剂有限公司。PCR仪为BIOER公司产品。PCR反应体系产品购自TaKaRa公司。VITEK2全自动细菌鉴定系统为梅里埃公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细菌分离与培养

发病大口黑鲈的主要症状为肝脾肿大、肾脏出血、体表鳞片脱落及出血。现场用75%乙醇棉球对病鱼体表进行消毒，无菌操作从肝脏取样，划线接种血琼脂平板。实验室28 ℃恒温培养24 h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，获得纯化菌株用于人工感染实验以及分子鉴定。

1.3 生理生化鉴定

取在RS平板上培养24 h的菌体，使用梅里埃公司的VITEK2全自动细菌鉴定系统进行分析。同时根据伯杰氏细菌分类手册[14]，设置补充理化实验，包括精氨酸双水解酶、七叶苷、羊血琼脂溶血实验，对分离菌株做进一步的理化鉴定。

1.4 分子鉴定

参照文献[23]分别合成扩增16S rRNA的通用引物和扩增gyrB的特异性引物。预期扩增片段长度分别为1 465和1 130 bp。16S rRNA上、下游引物序列分别为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和TACGGCTACCTTGTTACGACTT，gyrB上、下游引物序列分别为TCCGGCGGTCTGCACGGCGT和TTGTCCGGGTTGTACTCGTC。引物均由广州艾基生物技术有限公司合成。将纯化的菌株接种于BHI液体培养基，28 ℃摇床过夜培养。取1 mL菌液12 000 r·min−1离心1 min收集菌体。使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按照其操作指南提取基因组DNA。提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测质量，酶标仪测定DNA浓度。接着进行PCR反应，在50 μL的16S rRNA反应体系中含有ExTaq酶 25 μL、上下游引物各 2.5 μL、ddH2O 17.5 μL、模板2.5 μL。gyrB基因PCR反应体系同上。16S rRNA基因的PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，55 ℃ 复性 30 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。gyrB基因的PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后，PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后测序，序列测定由广州艾基生物技术有限公司完成。采用BLSAT程序 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 进行序列同源性比对。采用MEGA 7.0软件邻接法 (Neighborjoining, NJ) 构建进化树，设定Bootstrap为1 000。

1.5 回归感染实验

离心收集培养24 h的菌体，经10 mmol·L−1PBS洗涤后配制成细菌悬液。回归感染实验设3个实验组与1个对照组，每组各30尾。采用高、中、低 3 种不同菌液浓度 (3×108、1.5×108、3×107CFU·mL−1) 进行腹腔注射攻毒。健康大口黑鲈鱼苗每尾鱼注射100 μL。对照组注射等量无菌PBS。水温设定为30 ℃。每天观察、记录实验鱼死亡数量，连续观察1周。对上述人工回归感染出现明显症状的病鱼再次进行菌株分离与分子鉴定。

1.6 药敏实验

将分离菌株以 1.5×108CFU·mL−1的浓度涂布于BHI培养基平板上，贴上药敏纸片，共17种药物 (表1)，于28 ℃倒置培养24 h后测抑菌圈直径。按产品说明书判定菌株对各药物的敏感度。

表1 分离菌株GZXR2020对17种抗菌药物的敏感性Table 1 Antibiotic sensitivities of isolated strain GZXR2020 to 17 antibacterials

1.7 毒力基因扩增

根据文献[18,24]合成扩增肠毒素基因 (ast、act)、IV型菌毛基因 (tap A)、气溶素基因 (aer) 的特异性引物。预期扩增片段长度分别为331、233、550、431 bp。ast基因上、下游引物序列分别为TCTCCATGCTTCCCTTCCACT和GTGTAGGGATTGAAGAAGCCG，tap A基因上、下游引物序列分别为ATGACCTCTAGCCCCAA TA和ACCCGATTGATTTCTGCC，aer基因上、下游引物序列分别为CCTATGGCCTGAGCGAG AAG和CCAGTTCCAGTCCCACCACT，act基因上、下游引物序列分别为GAGAAGGTGACCACCA AGAACA和AACTGACATCGGCCTTGAACTC。引物均由广州艾基生物技术有限公司合成。使用1.4节提取的菌体基因组DNA进行PCR反应，ast、tap A、aer、act基因的反应体系为 20 μL，其中ExTaq酶10 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 7 μL、模板 1 μL。ast和tap A基因的PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，53 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。aer基因的PCR反应条件为：94 ℃预变性 2 min；94 ℃ 变性 30 s，55.9 ℃ 复性 50 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。act基因的PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃ 变性 30 s，56.4 ℃ 复性 50 s，72 ℃ 延伸 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，PCR反应产物均经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 细菌分离与菌落形态

从患病大口黑鲈肝脏划线接种于血平板，过夜培养后出现圆形凸起、表面光滑湿润的灰白色菌落，菌落形状一致。挑取血平板上的单菌落接种于BHI固体培养基上继续培养，取单一菌落进行生理生化实验，并命名为GZXR2020。

2.2 回归感染实验

对健康大口黑鲈实验鱼腹腔注射菌液，每组各30尾，连续观察7 d。感染后第1天，3×108CFU·mL−1组开始出现发病症状，鱼体色发黑，游动不正常。3种浓度的菌液均能引起攻毒实验鱼死亡。低浓度组2尾鱼死亡，死亡率为7%，中浓度组12尾鱼死亡，死亡率为40%，高浓度组30尾鱼死亡，死亡率为100%，对照组鱼无死亡。死亡个体出现维氏气单胞菌感染的典型症状 (图1)。回归感染实验证明该分离株为大口黑鲈的致病菌株。

图1 人工感染后大口黑鲈出现的症状a.鳞片脱落、尾鳍基部出血；b.病鱼肝脏、脾脏与肾脏肿大Figure 1 Symptoms of M.salmoides after artificial infectiona.Scale exfoliation, bleeding of the base of caudal fin; b.Swelling of liver, spleen and kidney of the infected fish

2.3 分离菌株16S rRNA和gyrB基因序列的扩增与分析

采用16S rRNA通用引物和gyrB基因特异性引物对分离菌株进行PCR扩增，分别获得大小为1 465和1 130 bp的序列。BLAST结果显示，所扩增的16S rRNA序列与GenBank上的维氏气单胞菌维罗纳生物型、维氏气单胞菌温和生物型、温和气单胞菌 (A.sobria)、嗜水气单胞菌 (A.hydrophila)的同源性分别为99.9%、99.5%、98.9%、98.6%。

该菌株的gyrB序列与维氏气单胞菌维罗纳生物型、维氏气单胞菌温和生物型、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌的同源性分别为98.7%、98.3%、93.3%、93.4%。根据16S rRNA与gyrB基因序列采用NJ法分别构建系统进化树，GZXR2020菌株与维氏气单胞菌维罗纳生物变种、维氏气单胞菌温和生物变种聚类，然后再与温和气单胞菌聚类，可确定分离菌为维氏气单胞菌 (图2)。

图2 根据细菌16S rRNA基因序列 (a) 与gyrB基因序列 (b) 构建的系统进化树Figure 2 Phylogenetic trees constructed based on sequences of 16S rRNA (a) and gyrB (b)

2.4 生理生化鉴定

采用梅里埃公司的VITEK2全自动细菌鉴定系统进行生理生化鉴定 (表2)。结果显示其与气单胞菌属的温和气单胞菌的相应特征相符。

表2 分离菌株GZXR2020的生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of strain GZXR2020

对分离菌株进行羊血-琼脂溶血实验 (图3)，结果显示呈β-溶血。结合全自动细菌鉴定系统与溶血实验结果，可判定该菌为维氏气单胞菌。

图3 分离菌株GZXR2020在羊血琼脂板上的β-溶血环a.分离菌株GZXR2020；b.大肠杆菌；标尺显示单菌落直径Figure 3 Beta hemolysis of isolated strain GZXR2020 on sheep blood agara.Isolated strain GZXR2020; b.E.coli.The bar shows the single colony diameter.

2.5 菌株生物型鉴定

毒力基因扩增结果显示，以分离菌株的DNA作模板，可扩增到act、tap A、aer基因，但ast基因缺失。维氏气单胞菌温和生物型具有act、tap A、aer基因，维氏气单胞菌维罗纳生物型具有act、ast、aer基因，此检测结果与维氏气单胞菌温和生物型一致，可进一步判断本分离菌株为维氏气单胞菌温和生物型。

精氨酸双水解酶与七叶苷实验结果显示，七叶苷水解实验为阴性，精氨酸双水解为阳性。维氏气单胞菌温和生物型七叶苷水解实验为阴性，精氨酸双水解为阳性，维氏气单胞菌维罗纳生物型叶苷水解实验为阳性，精氨酸双水解为阴性，实验结果符合维氏气单胞菌温和生物型。结合毒力基因检测与补充理化鉴定结果，可判定该分离菌为维氏气单胞菌温和生物型。

2.6 药敏实验

以涂布法对分离菌株进行药物敏感性检测(表1)，在所检测的17种抗菌药物中，大观霉素、氟罗沙星、氟苯尼考等7种药物呈敏感反应；卡那霉素、链霉素2种药物为中度敏感；妥布霉素、氨苄西林、复方新诺明等8种药物呈耐药性。

3 讨论

维氏气单胞菌包括维氏气单胞菌维罗纳生物型和维氏气单胞菌温和生物型，前者能引起人类败血症、上肢及皮肤软组织感染、胃肠道腹泻等疾病[25]，后者会导致人类腹泻、溶血、胆道脓血等[26]。维氏气单胞菌维罗纳生物型感染可造成乌鳢肝、脾、肾坏死充血，肠道损伤[18]。维氏气单胞菌温和生物型感染导致尼罗罗非鱼体色呈深黑色，背部出血，鳞片脱落，鳍条腐烂，患病鱼内脏严重充血，肝、脾、肾、脑、肠道和性腺肿大[17]。维氏气单胞菌不同生物型具有不同的理化特点，维氏气单胞菌温和生物型在理化检测中七叶苷水解为阴性、精氨酸双水解为阳性，维氏气单胞菌维罗纳生物型则相反。本研究在自然发病大口黑鲈鱼苗上分离得到菌株GZXR2020，腹腔注射对健康大口黑鲈攻毒，出现肝脾肿大、肾脏出血、体表鳞片脱落及出血等症状。高浓度菌液 (3×108CFU·mL−1) 可导致其100%死亡，说明该菌株具有较强的致病力。

采用梅里埃公司的VITEK2全自动细菌鉴定系统对菌株进行鉴定，结果显示为气单胞菌属的温和气单胞菌。该细菌鉴定系统可检测4种气单胞菌，可鉴定维氏气单胞菌维罗纳生物型，但不能鉴定维氏气单胞菌温和生物型。有研究显示，温和气单胞菌和维氏气单胞菌温和型菌株的理化特性比较接近，因此这2种气单胞菌鉴定时易混淆[27-29]。Brenner等[16]的研究显示通过羊血平板溶血实验，菌株是否具有溶血能力可区分两者。本研究通过羊血琼脂平板实验，发现该菌株在羊血琼脂平板上出现溶血现象 (图3)，因此判定该菌株为维氏气单胞菌。

在细菌分类鉴定中，分子鉴定具有更高的准确度。细菌16S rRNA基因因其序列的高保守性已被广泛应用于细菌鉴定。与16S rRNA 基因相比，gyrB基因具有较高的碱基替换率，更适合亲缘关系较近的菌种鉴别[30-33]。因此本研究结合16S rRNA和gyrB这2个基因对该分离菌株进行分子鉴定。16S rRNA碱基序列与维氏气单胞菌维罗纳生物型的标准株ATCC 35624的同源性为99.9%，与维氏气单胞菌温和生物型的菌株AER28的同源性为99.5%，但与温和气单胞菌、嗜水气单胞菌的同源性也较高，分别为98.9%和98.6%，分辨力不足。

进一步分析gyrB碱基序列，该菌株gyrB碱基序列与维氏气单胞菌维罗纳生物型的标准株ATCC 35624的同源性为98.7%，与维氏气单胞菌温和生物型菌株AER28的同源性为98.3%。与温和气单胞菌和嗜水气单胞菌的同源性则相对较低，分别为93.3%和93.4%。因此结合16S rRNA和gyrB基因分子鉴定结果，可判断该分离株为维氏气单胞菌。但由于该分离株16S rRNA和gyrB这2个基因序列与维氏气单胞菌维罗纳生物型和温和生物型的序列同源性相近，尚无法确定其属于维氏气单胞菌的哪种生物型。

Altwegg等[34]认为维氏气单胞菌两生物型的遗传特性一致。本研究从NCBI下载8条维氏气单胞菌温和生物型16S rRNA序列、19条维氏气单胞菌维罗纳生物型 (包括标准株ATCC 35624) 16S rRNA基因序列，比较发现维氏气单胞菌2种生物型的碱基序列高度保守，以NCBI上传本序列 (Gen-Bank号MW148391) 为基准，只在其中的第949与第956碱基位点存在差异。第949位点为C或T变化，第956位点则为A或G变化，2种生物型均有此种两碱基的差异，因此从16S rRNA基因的碱基序列上确实无法分辨两生物型。Brenner等[16]的研究表明通过精氨酸双水解实验和七叶苷水解实验可区分维氏气单胞菌温和生物型和维罗纳生物型。本研究分离的菌株其精氨酸双水解实验为阳性，七叶苷水解实验为阴性，因此可确定该菌株为维氏气单胞菌温和生物型。Shameena等[24]通过ast、tap A毒力基因的携带与否成功区分维氏气单胞菌温和生物型和维罗纳生物型。本研究检测4种毒力基因 [ 肠毒素基因 (ast、act)、IV型菌毛基因(tap A)、气溶素 (aer)]，发现菌株ast毒力基因缺失，但能检测到tap A毒力基因，因此可进一步确定菌株为维氏气单胞菌温和生物型。综合生理生化、分子鉴定与毒力基因检测结果，可判定本研究分离的菌株为维氏气单胞菌温和生物型。

维氏气单胞菌的最适生长温度为28～37 ℃[5]。近年来已有多例维氏气单胞菌感染导致大口黑鲈苗种或成鱼死亡的报道[19-22]，暴发时间多在7月。查询相关的气象资料发现，当时在江苏、四川与湖北大口黑鲈发病季节的温度介于24～34 ℃，而本研究病害暴发时间是5月。广东地区为亚热带季风气候，气温与水温较内陆提升较快，5月佛山的水温已达25～32 ℃。4—5月是广东大口黑鲈鱼苗标粗期，也是各主养区对规格苗种需求量最大的时期，维氏气单胞菌的感染导致大口黑鲈鱼苗的大量死亡，严重影响了池塘放养计划，甚至造成无苗可养的局面。鱼苗培育过程中大规模死亡有逐年加剧的趋势。温度的升高以及育苗系统中水质的维持压力增大，导致维氏气单胞菌感染增殖，从而引发苗种批量死亡。由于近年来大口黑鲈病毒携带情况有所加重[35]，因此不排除病毒与细菌混合感染加剧鱼苗死亡的可能性。维持良好的水环境、提高鱼体的免疫力是大口黑鲈育苗与养殖成功的关键。

本研究的药敏实验共分析了17种药物，其中敏感性药物7种，包括大观霉素、利福平和四环素等，占比为41%；耐药药物8种，包括阿莫西林、青霉素和氨苄西林等，占比为47%。本研究中卡那霉素与链霉素属于中等敏感药物，利福平和四环素属于敏感药物，但以往研究表明大口黑鲈对这4种药物均显示出耐药性[19,21-22]。这种由耐药性到敏感性的变化，说明我国制定的一系列控制渔业药物限制使用的法律法规已初见成效，水产养殖人员药物使用意识有所提高。由于在大口黑鲈育苗和养殖过程中存在病害加剧的趋势，极易出现滥用药引发的产品质量安全问题。因此，大口黑鲈养殖应注重科学管理与生态调控，减少药物用量，安全用药，不使用禁用药物，以保证养殖的顺利进行与产品的质量安全。