PD-1/PD-L1在子宫内膜样腺癌发生、发展中的表达及其临床意义

张梦雪 孙慧敏 高建芳 张维新 柳 林

子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系统中最常见的三大恶性肿瘤之一，其发生率在世界范围内逐年上升，呈现出年轻化趋势[1]。其病理类型以子宫内膜样腺癌为主，约占80%～90%。早期EC可行手术治疗，预后良好，5年生存率为74%～91%，而Ⅰb～Ⅳ期、复发及Ⅰa期伴高危因素的患者手术疗效不佳，5年生存率仅20%～26%，尚需辅助放化疗或联合治疗等[2]。近年来，PD-1/PD-L1等免疫检查点成为新的研究热点，免疫治疗或成为新的癌症治疗方案之一[3]。

程序性细胞死亡受体-1(programmed cell death protein 1, PD-1)，主要表达于T淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞，是由PDCD1基因编码的Ⅰ型膜蛋白，其配体为PD-L1和PD-L2。程序性细胞死亡配体-1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)是一种由CD274基因编码的跨膜蛋白，可广泛表达于T淋巴细胞等免疫细胞以及心、肺等器官[4～6]。当PD-L1与活化T淋巴细胞表面PD-1结合时，可阻断抗原递呈信号转导，阻碍机体的免疫监视作用，有利于肿瘤细胞的免疫逃逸[7]。Konishi等[8]于2004年证明了PD-L1在非小细胞肺癌组织中的高表达，提出PD-1/PD-L1信号通路可能为非小细胞肺癌抗肿瘤免疫应答的负调控机制之一。随后研究者陆续在头颈癌、结膜黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织发现了PD-1、PD-L1阳性表达，提示其与实体肿瘤的相关性[9～12]。本研究通过检测PD-1、PD-L1在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达情况，初步分析其与临床病理特征的相关性，从而探讨其与子宫内膜样腺癌的发生、发展中的关系，以期为子宫内膜癌的免疫治疗提供更多的理论依据。

对象与方法

1.实验对象:石蜡切块组织选自2015年1月～2020年5月山东省潍坊市人民医院病理科的150例患者，分为正常子宫内膜组(对照组)，患者平均年龄56.0岁；子宫内膜不典型增生组(实验组A)，患者平均年龄52.3岁；高分化子宫内膜样腺癌组(实验组B)，患者平均年龄57岁；中分化子宫内膜样腺癌组(实验组C)，患者平均年龄57.8岁；低分化子宫内膜样腺癌组(实验组D)，患者平均年龄58.2岁，每组30例。所有纳入对象术前均未接受过放化疗或雌孕激素治疗，未合并其他恶性肿瘤，临床病理资料完整。

2.主要设备及试剂：采用常州派斯杰医疗设备有限公司提供的组织包埋冷冻台、组织漂烘仪及石蜡切片机等，小鼠抗人PD-1/PD-L1单克隆抗体、小鼠/兔聚合物通用型试剂盒、EDTA抗原修复液等购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

3.方法：所有组织标本均按3μm连续切片。免疫组化采用EnVision二步法，步骤严格按产品说明书进行。常规烤片、脱蜡后进行高压修复，选用pH值9.0 EDTA抗原修复液修复，3%H2O2进行阻断，随后依次滴加一抗(小鼠抗人PD-1/PD-L1单克隆抗体)、二抗(酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，随后显色、复染、透明后中性树胶封片，显微镜下阅片。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，采用已知PD-1及PD-L1表达阳性的扁桃体组织为阳性对照。

4.结果判读标准：由两名经验丰富的病理医生独立双盲完成结果读取。先低倍镜下观察，随后在肿瘤或肿瘤间质区随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞，阳性细胞率=阳性细胞数/观察细胞数×100%。染色强度分级：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞密度分级：<1%为0分，1%～5%为1分，5%～50%为2分，>50%为3分。两项得分相乘，结果0～1分为阴性表达，2～9分为阳性表达。

5.统计学方法：采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计分析。组间差异比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，计数资料分析采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.不同子宫内膜组织中 PD-1及PD-L1的表达水平:EnVision法显示PD-1、PD-L1抗原阳性物为棕黄色颗粒，均定位于细胞膜和细胞质内。PD-1可表达于子宫内膜样腺癌周围浸润的淋巴细胞上，细胞表现为小圆形，核大质少，点样分布；PD-L1可表达于子宫内膜样腺癌细胞及癌间质浸润的淋巴细胞上(图1)。PD-1在子宫内膜样腺癌间质浸润淋巴细胞的阳性表达率为28.89%(26/90)，高于子宫内膜不典型增生组织(3.33%)和正常子宫内膜组织(0)，差异有统计学意义(P<0.01)；但在子宫内膜样腺癌细胞中均未见阳性表达。PD-L1在子宫内膜样腺癌中的阳性表达率为46.67%(42/90)，高于子宫内膜不典型增生组织(3.33%)和正常子宫内膜组织(0)，差异有统计学意义(P<0.01)。PD-1在子宫内膜样腺癌间质淋巴细胞的阳性表达率按分化程度由低到高依次为43.33%、30.00%、13.33%, 差异有统计学意义(χ2=27.819,P<0.01)；PD-L1在子宫内膜样腺癌的阳性表达率按分化程度由低到高依次为63.33%、46.67%、30.00%，差异有统计学意义(χ2=43.589,P<0.01，表1)。

表1 PD-1、PD-L1在不同子宫内膜及间质组织中的表达率[n(%)]

图1 PD-1在子宫内膜上的表达(EnVision法，×400)

2.PD-1和PD-L1与子宫内膜样腺癌临床病理特征的关系:分析90例子宫内膜样腺癌患者中PD-1和PD-L1的表达(表2)。PD-1和PD-L1的表达与子宫内膜样腺癌患者的FIGO分期、年龄及淋巴结转移无关，差异无统计学意义(P>0.05)，但与子宫内膜样腺癌组织学分级有关，差异有统计学意义(P<0.05)。组织学分级为低分化(G3)、中分化(G2)、高分化(G1)者PD-1和PD-L1的阳性表达率逐步上升，3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；此外，肿瘤浸润程度达深肌层及以上者的PD-L1的阳性表达率明显高于未侵及深肌层者，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 子宫内膜样腺癌组织中PD-1、PD-L1表达与临床病理特征的关系

讨 论

对PD-1/PD-L1通路的研究表明，正常机体中T淋巴细胞在静息状态下低表达PD-1，抗原进入机体后，抗原递呈细胞(antigen-presenting cells, APC)递呈的抗原肽与T淋巴细胞受体(T cell receptor，TCR)结合，同时B7分子与CD28协同作用传递信号，从而激活T淋巴细胞，分化增殖为效应T细胞发挥免疫杀伤作用。而T淋巴细胞的激活可引起PD-1的表达上调，在TCR的刺激下，PD-1与PD-L1结合促使PD-1胞内区ITIM和ITSM酪氨酸磷酸化，并与SHP-1或SHP-2结合并使之磷酸化，进一步引起PTEN表达上调，从而抑制PI3K/Akt信号通路活性，Akt活性的阻滞最终抑制下游T淋巴细胞的增殖与活化[13～15]。这种负反馈调节作用能够维持T细胞的动态平衡，对抗原的清除以及维持机体平衡至关重要[16]。当人体被肿瘤侵袭时，将打破机体免疫微环境稳态，肿瘤细胞表面的PD-L1与T淋巴细胞表面的PD-1特异性结合，通过激活PD-1/PD-L1下游通路，过度抑制T淋巴细胞的增殖分化，并招募免疫抑制细胞及细胞因子，降低肿瘤细胞抗原性以逃避机体免疫系统的杀伤作用，形成肿瘤免疫逃逸[17,18]。因此，阻断PD-1/PD-L1信号通路能重启免疫监视，恢复T淋巴细胞等免疫细胞的抗肿瘤作用，是肿瘤免疫治疗的一个新靶点。

在子宫内膜癌方面，国外已有少数病例研究报告了PD-1抑制剂在子宫内膜癌治疗中的疗效。如Fader等[19]报道了应用PD-1抑制剂Pembrolizumab治疗错配修复基因缺陷型复发性EC，总反应率和疾病控制率可达55%和89%。证实了PD-1/PD-L1免疫治疗确实能让部分EC患者获益，但缺乏实验研究阐述PD-1/PD-L1表达与子宫内膜癌中发生、发展的关系，对于能否将PD-1/PD-L1作为子宫内膜癌的预后评估因素，如何有效筛选获益患者，有待于进一步研究。

本研究结果表明，PD-1/PD-L1在子宫内膜样腺癌的表达水平显著高于在子宫内膜不典型增生和正常子宫内膜，且随着子宫内膜样腺癌分化程度的降低表达水平上升。因此PD-1/PD-L1通路的确参与了子宫内膜样腺癌的发生、发展过程，但其分子机制尚需基础研究来阐明。此外有两个意外现象，当子宫内膜样腺癌肿瘤细胞出现一定水平鳞化后，PD-L1的表达水平上升，而在少数合并透明细胞癌等恶性程度较高的组织中，PD-L1表达水平也有显著上升。故推测PD-L1表达水平或与肿瘤细胞的病理类型密切相关，这一假设尚需数据支持。

此外，本研究进一步分析了PD-1/PD-L1表达水平与子宫内膜样腺癌的临床病理特征之间的关系。发现PD-1/PD-L1的表达与子宫内膜样腺癌的组织学分级相关，且随着肿瘤恶性程度的增加，PD-1/PD-L1表达水平上升，这也提示了PD-1/PD-L1可能参与了子宫内膜样腺癌的发生、发展。尽管实验未能证明PD-1/PD-L1的表达与子宫内膜样腺癌的FIGO分期相关，但已发现PD-L1的表达水平与子宫内膜样腺癌的肌层浸润程度相关，且随着浸润程度加深，PD-L1表达水平上升。考虑到实验纳入的病例数尚不充足，若扩大样本量或能够验证其与肿瘤FIGO分期的关系。

综上所述，本研究证实了PD-1/PD-L1在子宫内膜样腺癌组织中存在显著表达上调，且表达水平随着子宫内膜样腺癌的恶性程度加重而上升，提示PD-1/PD-L1表达或参与了子宫内膜样腺癌的发生、发展过程。但研究尚存不足之处，即PD-1/PD-L1表达水平低于相关研究中同种病理类型的肺腺癌、卵巢癌的表达水平，且选取的病例随访时间较短，未能进一步研究生存分析，因此建议开展多中心、大样本量的研究，全面分析PD-1/PD-L1通路在子宫内膜癌发展中的作用，以筛选获益人群，提高PD-1/PD-L1免疫治疗在临床中的疗效和安全性。