TENM4 基因rs4483616 位点多态性与江西省汉族人群免疫性血小板减少症的相关性研究

赵 翠 徐颜美 杨文涛 李 静 黄 波 刘 静 林 晋 杨伟明 张 静 王小中

免疫性血小板减少症(immunethrombocytopenia，ITP)是一种获得性自身免疫性疾病，其特点为体内血小板产生减少和破坏过多，循环血小板数量显著减少，出血风险增加[1,2]。目前认为 ITP主要由细胞和体液免疫因素导致[3]。近年来，研究者认为遗传因素在 ITP 发生、发展过程中起重要作用，且通过多种遗传学分析手段发现多种基因多态性可能是 ITP发生的易感因素[3～5]。笔者团队前期通过全基因组关联研究(genome-wideassociationstudy，GWAS)发现TENM4 rs4483616(P=0.000)与中国江西省汉族人群显著相关,因当时技术问题无法合成探针引物,故未对其进行基因分型[6]。本研究将完善前期实验,采用 TaqMan 法检测TENM4基因rs4483616 位点基因型，探讨其基因型及等位基因频率分布与 ITP 的易感相关性。

材料与方法

1.研究对象:于2015年6月～2018年10月，纳入于笔者医院血液内科就诊并符合《成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识(修订版)》诊断标准的成人 ITP 患者 200 例为病例组[7]。本研究排除了招募家族性 ITP 病例。另外，排除其他类型的血小板减少，如肝素诱导的血小板计数减少或药物诱导的血小板计数减少。同期收集于笔者医院体检的180例性别、种族等相匹配的健康受试者为对照组。同时，收集所有受试者的临床基本资料。所有受试者均签署知情同意书，本研究经南昌大学第二附属医院医学伦理学委员会审批。

2.仪器与试剂:LineGene 9600 实时荧光定量 PCR 仪(杭州博日科技有限公司)，K960 PCR 仪(力新仪器有限公司)，MINIP-2500 微孔板离心机(杭州米欧仪器有限公司)，Theromo NanoDrop 2000C 紫外/可见分光光度定量仪(中国赛默飞世尔科技有限公司)，PCR 引物、血液基因组柱式提取试剂盒、探针(北京Tsingke 公司)，灭菌水(实验室自备)。

3.基因组 DNA提取及检测:收集 ITP 患者及健康对照者 EDTA-K2 抗凝全血 3～4ml。根据 Tsingke 公司的基因组提取试剂盒说明书，从 200 例病例和180例对照中提取外周血白细胞的基因组 DNA。使用 Theromo NanoDrop 2000C 紫外/可见分光光度定量仪器计算DNA 浓度和纯度，选择浓度和纯度合格的基因组 DNA 样品，以进一步进行基因分型检测。

4.探针及引物序列：rs4483616的引物及探针由 Tsingke 公司设计合成，具体序列如下：上游引物：5′-TCATGCTTTCCCTCCGTGG-3′，下游引物：5′-TCAGCTGAGGGTCAGGGAT-3′；探针1：5′-TGGATCCACTCTAAG-3′，探针2：5′-ATCCACTCCAAGAC-3′。PCR总反应体系为 20μl，反应条件为 95℃ 2min，95℃ 10s，60℃ 35s，共40个循环。反应在 LineGene9600 实时荧光定量 PCR仪(杭州博日科技有限公司)进行，利用Genotyper软件进行基因分型检测。

结 果

1.一般临床特点:本研究招募的所有 ITP 患者均表现出相似的典型症状和体征。各受试者之间无血缘关系，无其他遗传性疾病，均为江西省汉族人群。病例组与对照组受试者的年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，所有受试者的一般临床特征详见表1。

表1 病例组与对照组的一般临床资料

2.Hardy-Weinberg平衡检验结果结果：患者和对照组人群 rs4483616 位点的基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。本研究招募的人群来自遗传平衡群体，详见表2。

表2 基因型频数分布的 Hardy-Weinberg平衡检验

3.rs4483616位点等位基因的探针分型结果:rs4483616位点具有两种等位基因分别是C和T，共3种基因型分别是CC、CT和TT。本实验分型结果显示病例组CC型196例，CT型4例，TT型0例；对照组CC型166例，CT型14例，TT型0例。实验结果与人类基因组计划(HapMap)公布的中国北京人的 SNP 分型数据一致。

4.rs4483616位点基因型频率和等位基因频率与 ITP 的关系:ITP病例组rs4483616位点CC、CT和TT基因型频率分别为98.0%、2.0%和0，对照组的基因型频率分别为92.2%、7.8%和0。rs4483616位点与ITP疾病的发生存在一定的风险(OR=4.133,95% CI:1.335～12.796)，该位点的基因型频率在两组间比较，差异有统计学意义(χ2=7.009，P=0.008)，其中CC基因在病例组分布频率高于对照组(P<0.05)(表3)。在ITP病例组和对照组中等位基因C的频率分别为99.0%和96.1%，等位基因T在ITP病例组和对照组中的频率分别为1.0%和3.9%。两组人群间等位基因频率差异有统计学意义(χ2=6.839，P=0.009)。ITP疾病组中C等位基因频率与对照组比较，OR=4.006(95% CI：1.799～8.918)；T等位基因频率与对照组比较，OR=0.292(95% CI：0.131～0.649，表4)。

表3 rs4483616 位点基因型频率分布及其与ITP的关系基因型[n(%)]

表4 rs4483616位点等位基因频率分布及其与ITP的关系

讨 论

SNP是人类遗传变异中最常见的类型，在人类基因组中广泛存在。已有多项研究报道了基因的SNP与ITP的发生相关[4,8～10]。TENM4基因位于11号染色体上，含有34个外显子，编码一个由2769个氨基酸残基组成的蛋白质。到目前为止，该基因的分子功能尚未明确。它可能是一种Ⅱ型跨膜蛋白，具有细胞信号转换器的功能[11]。Park等[12]研究了TENM4基因多态性在高血压患者中的易感性，发现TENM4 rs10466739与高血压呈正相关。近年来有报道TENM4基因变异与常染色体显性遗传的原发性震颤、双相情感障碍有关[13,14]。精神分裂症具有高度的遗传异质性，TENM4基因是精神分裂症的候选基因[11]。众所周知，许多遗传性疾病有相似的潜在病因，并有共同的易感基因。笔者团队前期通过GWAS筛选出TENM4基因rs4483616位点与中国江西省汉族人群显著相关，可能是ITP的易感基因位点[6]。因此本研究进一步探究TENM4基因rs4483616位点基因型及等位基因频率分布与ITP的易感相关性。

目前国内外尚无TENM4基因多态性与ITP的关联性研究。本研究结果显示TENM4基因rs4483616位点单核苷酸多态性的基因型频率都达到遗传平衡，具有群体代表性。ITP病例组rs4483616位点CC基因型频率(98.0%)高于对照组(92.2%)，而且两组间rs4483616位点的等位基因频率及基因型频率的差异有统计学意义(P<0.05)。ITP病例组中C等位基因频率与对照组比较，OR=4.006(95% CI：1.799～8.918)；T等位基因频率与对照相比较，OR=0.292(95% CI：0.131～0.649)，提示C等位基因可能是ITP发病的危险等位基因，T等位基因可能是ITP发病的保护等位基因。研究表明，TENM4基因rs4483616位点可能是江西省汉族人群ITP的易感基因位点。

本研究尚有不足之处，由于研究样本量有限，研究对象种族、地域局限，因此研究中观察到的结果有待于扩大样本量予以进一步证实。需要从不同地域、不同种族及人种分析研究TENM4基因多态性与ITP易感性之间的关联，同时联合其他ITP易感基因，以提高个体ITP病易感性的预测水平，筛选出高危人群，从而加强ITP的早期预防、诊断及治疗。