碘液浸染在Micro-CT下识别小鼠颅底-颞下区肿瘤组织中的应用

杨 榕，李庆祥，王逸飞，周 闻，王 雯，郭传瑸，刘 浩△，郭玉兴△

(1.北京大学口腔医学院·口腔医院，口腔颌面外科 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081；2.北京大学口腔医学院·口腔医院中心实验室，北京 100081；3.河北医科大学口腔医院正畸科，石家庄 050017)

颅底-颞下区肿瘤位置深在，毗邻沟通颅内外的颈内动、静脉和Ⅸ～Ⅻ颅神经[1]，在临床操作时入路困难[2-3]。采用CT影像技术，尤其是增强CT技术经导航设计软件行三维重建可以充分显示肿瘤范围和颈内动脉、颈内静脉及颅颌面骨性结构，据此可设计穿刺活检或肿瘤切除手术方案[4-5]，但手术过程中常无法对颅底恶性肿瘤进行充分的扩大切除，手术后常需辅以放疗或化疗，常见肿瘤复发和远处转移[6]。

为了更好地研究颅底-颞下区恶性肿瘤的肿瘤发生和生长特点，我们尝试建立了颅底-颞下区恶性肿瘤小鼠模型。在利用Micro-CT分析动物模型时，虽然其可精确显影矿化组织[7]，但由于软组织对X线的衰减作用小，无法形成良好的软组织对比度，因此无法对肿瘤及周围软组织实现有效评估。既往研究多采用对比增强剂(碘制剂及四氧化锇等)浸染以提高软组织分辨率[8]。本研究中我们尝试利用组织渗透性强、毒性低、易于获取的复方碘液进行颅底肿瘤小鼠标本浸染，显著提升了软组织观察效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

12只BALB/c裸鼠4～5周龄，体质量14～16 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为SCXK(京)2016-0011。达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)购自美国Gibco公司，10%(体积分数)胎牛血清购自美国HyClone公司，0.1 U/L青霉素和100 g/L链霉素购自美国Gibco公司，5%(质量分数)复方碘液购自山东临沂永安化验室，苏木精-伊红染液、兔抗人广谱细胞角蛋白多克隆抗体(26411-1-AP)购自美国Proteintech公司，PV-9001兔二步法检测试剂盒及二氨基联苯胺显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。小动物超声系统(VisualSonics Vevo®1100)购自加拿大，Micro-CT(西门子Inveon MM Gantry-STD)购自德国，影像数据分析软件(iPlan 3.0 BrainLAB)购自德国。

1.2 动物模型建立

试验方案获得北京大学生物医学伦理委员会审批通过(批准号：LA2018247)。试验开始前1周，将小鼠在标准条件下饲养于北京大学口腔医院实验动物中心。头颈鳞状细胞癌细胞系WSU-HN6来自北京大学口腔医院中心实验室。培养箱条件为37 ℃、5%(体积分数)二氧化碳。

采用吸入式简易麻醉仪以异氟烷对小鼠镇静麻醉后，将其固定于操作台，采用小动物超声行颌下区扫描，判断颈部主要血管位置。然后用1 mL胰岛素注射器，将20 μL含有2×106个的WSU-HN6细胞经右侧颌下区注射至右侧颞下窝区域。注射细胞时，左手固定小鼠头部及背部，右手持注射器贴小鼠右侧下颌骨下缘进针。进针深度约4 mm，缓慢注射细胞，完成注射后停顿30 s，快速撤出注射器避免针道肿瘤种植。细胞注射后每隔1 d观察小鼠活动状态，至第3周，小鼠经过量二氧化碳安乐死后脱颈处理。解剖小鼠头颅标本，以4%(体积分数)多聚甲醛溶液固定24 h以上。

1.3 3.75%复方碘液浸染

将100 mL 5%复方碘液中加入300 mL蒸馏水，浓度稀释至3.75%[9]。碘单质(I2)在水中的溶解度极小，但在碘化钾(KI)溶液中可以与解离的碘离子(I-)结合形成稳定的I3-，即为复方碘液中的活性物质[10]。将固定后的小鼠头颅标本使用3.75%复方碘液持续浸染4 d。

1.4 Micro-CT影像扫描及数据分析

小鼠头颅标本固定后先行非碘液处理扫描，再经3.75%复方碘液浸染4 d后使用磷酸盐缓冲液充分冲洗标本，重新行Micro-CT扫描[11]。两次扫描条件一致，均为9 μm、60 kV、220 μA，扫描数据以DICOM格式存储。以上两组扫描的DICOM影像数据导入影像数据分析软件，比较分析颅底肿瘤位置和颅骨完整性。

1.5 组织学评价

小鼠头颅标本去皮后，采用20% (体积分数)乙二胺四乙酸脱钙2～4周，经系列浓度乙醇脱水，石蜡包埋后行组织连续切片，层厚5～6 μm，以标准方法进行苏木精-伊红染色。采用非生物素即用型二步法免疫组织化学方法染色，检测广谱细胞角蛋白的表达。病理学切片采用光学显微镜及体视显微镜进行观察、拍照。

2 结果

2.1 动物建模情况

在对12只小鼠进行细胞注射的过程中2只出现颈部血肿立即死亡，其余小鼠采用小动物超声定期检查，术后3周可见到两侧颌下区出现明显不对称，由此初步判断肿瘤已经形成。采用过量二氧化碳进行安乐死处理后，以4%多聚甲醛固定头部标本，进行后续检查、分析。

2.2 Micro-CT扫描结果

用Micro-CT扫描非碘液处理的标本，发现小鼠颅骨整体不对称，下颌升支内侧可见部分压迫吸收，颞骨鳞部骨破坏明显，但无法辨别软组织影像(图1A、B)。经3.75%复方碘液浸染4 d后，在Micro-CT中可以清晰分辨软组织影像。经过辨认咀嚼肌的分布走行轮廓，并与肿瘤细胞注射侧进行比较分析，可见颅底肿物的主体位于下颌升支内侧、颞骨鳞部下、外侧，肿物经颧弓向侧面部突出(图1C、D)。

A,B,coronal and axial views of Micro-CT scan before compound iodine solution staining indicated the bony invasion on the right side of the skull base easily (white arrows),but couldn’t determine the tumor location precisely;C,D,coronal and axial views of Micro-CT scan after compound iodine solution staining,reflected the skull base tumor (red dotted lines) from the surrounded muscles easily.图1 采用3.75%复方碘液浸染前后小鼠Micro-CT影像学表现Figure 1 Micro-CT images of nude mice before and after staining with compound iodine solution

2.3 苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色分析

苏木精-伊红染色观察发现肿瘤与周围软组织结构界限清晰。免疫组织化学染色显示肿瘤为上皮来源的鳞状细胞癌，同时在颅骨破坏的区域可以看见多核的破骨细胞(图2)。

A,H-E staining showed a mass of atypia epithelial cells from the skull base tumor specimen;B,human cytokeratin immunohistochemical staining showed that the tumor was epithelial-derived squamous cell carcinoma;C,H-E staining of the destruction region of skull bone,red box shows the bone tissue with empty bone lacuna,black dotted box was enlarged as the figure 2D;D,the polynuclear osteoclasts at the margin of skull base bone resorption indicated by red arrow.图2 苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察颅底肿瘤特点Figure 2 Skull base tumors of murine model verified using H-E and immunohistochemical staining

3 讨论

我们的既往研究提示肿瘤与颅底位置关系、肿瘤恶性程度及肿瘤大小都是影响肿瘤预后的重要因素，而肿瘤局部复发是治疗失败最常见的原因[6]。为了更好地进行颅底-颞下区肿瘤的诊断及治疗研究，需要建立颅底-颞下区肿瘤动物模型。查阅文献后我们发现目前国内外并没有颅底-颞下区肿瘤动物模型，为此我们尝试建立了小鼠颅底-颞下区肿瘤动物模型。

在实验结果评价过程中，我们发现Micro-CT扫描虽可清晰显示颅骨形态及骨破坏的部位及程度，但肿瘤及周围软组织密度均一，无法辨别肿瘤的位置、边界等结构特征。文献报道碘制剂浸染是个理想的选择，2009年Metscher[11]利用10%复方碘液对胚胎标本浸染后行Micro-CT扫描，取得了良好的软组织分辨率，之后Jeffery等[10]及Wu等[12-13]学者研究显示，将人体或动物标本浸染于3.75%复方碘液7 d后再行Micro-CT扫描即可取得稳定、清晰的肌纤维及脂肪等软组织影像，其原理主要在于碘(I)元素具有较高的原子序数(53)及原子量(126.9)，可引起很强的X线衰减和电子背散射作用。软组织浸染后，由于I3-与不同组织亲和力不尽相同，导致碘元素分布差异，不同软组织间的密度差异增大，从而使X线影像出现明显差异[14]，弥补了软组织在Micro-CT影像中的低对比度缺陷。我们发现经过3.75%复方碘液浸染小鼠头颅标本4 d后再行Micro-CT扫描即可清晰辨认肿瘤、软组织(主要为肌纤维和脂肪组织)及颅骨结构。

为了进一步验证动物模型的肿瘤形成情况，我们随之进行组织学观察。苏木精-伊红染色可以证实颅底区确有肿瘤形成，且肿瘤靠近中心部位有坏死灶发生。同时我们还观察到颅骨破坏区存在多核破骨细胞，为了明确所形成肿瘤与我们植入的肿瘤细胞是否来源一致，我们进行了人角蛋白的免疫组织化学染色。兔抗人广谱细胞角蛋白抗体可标记人上皮细胞来源的肿瘤，其结果证实小鼠右侧颅底区的组织团块确为人源性上皮来源的鳞状细胞癌。

以上证据表明经过我们的方法可以成功建立颅底-颞下区肿瘤动物模型。复方碘液浸染在Micro-CT观察中有很重要的作用，它是一种组织渗透性强、毒性低、操作简便且易于获得的对比增强剂，可以帮助清晰分析肿瘤、相邻颅骨及周围软组织形态，在肿瘤的骨侵犯研究中有着明显优势。对于颅底-颞下区肿瘤的特点还可以采用Micro-MRI进行检测分析，但其无法显示清晰显示颅骨骨质特征，并且价格昂贵，所以普及率低，因此，我们建立的这种颅底-颞下区恶性肿瘤动物模型可以模拟临床情况，根据肿瘤特点进行相应的放射治疗、化学治疗，采用3.75%复方碘液浸染后再行Micro-CT扫描可以很好地进行治疗效果评价。