肉鸡滑液囊支原体的分离鉴定和药敏试验

刘春凌 王鹏 利凯

摘要 通过分离培养张家口某鸡场MS菌株，采用PCR方法扩增MS 16S RNA，并对分离培养菌株进行药敏试验。结果显示，感染MS肉鸡站立困难，跗关节和爪垫肿胀，分离培养的病原体菌落为光滑、圆形，小面积“煎蛋样”。PCR产物在207 bp处出现条带。药敏试验发现该菌落对酒石酸泰乐菌素和延胡索酸泰妙菌素敏感，最小抑菌浓度分别为0.122和0.244 μg/mL。因此，可确定该鸡场已感染滑液囊支原体，推荐使用酒石酸泰乐菌素或延胡索酸泰妙菌素作为首选抑菌治疗药物。

关键词 滑液囊支原体;分离;鉴定;PCR;药敏试验

中图分类号 S852.62 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）09-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.023

Abstract Mycoplasma synoviae（MS）strains were isolated from a chicken farm in Zhangjiakou and cultured，PCR method was used to amplify 16S RNA of MS. And drug sensitivity test was made on the isolated stains. The results showed that broilers infected with MS had difficulty in standing， swelling of the tarsal joints and paw pads， and the isolated and cultured pathogen colonies were smooth， round， with “fried egg-like” small areas. PCR product showed a band at 207 bp. The drug susceptibility test showed that the colony was sensitive to tylosin tartrate and tiamulin fumarate， and the minimum inhibitory concentrations were 0.122 and 0.244 μg/mL， respectively. Therefore， it could be determined that the chicken farm was infected with MS， and it was recommended to use tylosin tartrate or tiamulin fumarate as the first antibacterial medicine.

Key words Mycoplasma synoviae;Isolation;Identification;PCR;Drug sensitivity test

滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是鸡体中重要的致病性病原体之一，通过呼吸道感染进入鸡只体内，会导致鸡只生长发育迟缓和滑膜炎的发生，同时容易与其他疾病混合感染，加剧死亡，给鸡场带来严重的经济损失[1-2]。MS同时具有水平传播和垂直传播的特性[3-4]。目前防治肉鸡MS感染主要依靠抗生素，但随着药物使用时间的延长和使用范围的扩大，其防治效果将越来越差。笔者通过分离培养张家口某鸡场菌株，采用特异性PCR检测和药敏试验，结合临床症状和分离培养鉴别MS，并筛选出集中敏感药物，以期为张家口地区MS病防治药物的合理使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基。

支原体精氨酸肉汤培养基（产品编号HB7025-5）、支原体琼脂培养基（编号HB7025-3）、支原体肉汤培养基（产品编号HB7025-2），均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂。

血液/细胞/组织基因组总RNA提取试剂盒（产品编号ZP311），第一链反转录试剂盒-耐高温酶（产品编号ZR102-1），2×Ftaq PCR MasterMix（产品编号ZT201-1），DL2000 DNA Marker（产品编号ZM404-1），GoldViewTM核酸染料I（产品编号ZS209），均购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司;标准小牛血清（产品编号CS-XQ0301），购自上海莼试生物技术有限公司。

1.1.3 药敏试验用药。

延胡索酸泰妙菌素（批号为兽药字300111320，购自山东胜利生物工程有限公司），磷酸替米考星（批号为兽药字190801599，购自河北天象生物药业有限公司），氟苯尼考（批号为兽药字163231120，购自华畜兽药有限公司），盐酸环丙沙星（批号为兽药字150512606，购自山东鲁西兽药股份有限公司），盐酸多西环素（批号为兽药字163236011，购自华畜兽药有限公司），硫酸庆大霉素（批号为兽药原字110132337，购自华北制药有限责任公司），盐酸林可霉素（批号为兽药字161016081，购自华畜兽药有限公司），盐酸沙拉沙星（批号为兽药字161012630，购自华畜兽药有限公司），酒石酸泰乐菌素（批号为兽药字161012733，购自华畜兽药有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 支原体分离、鉴定培养基的制作。

严格按照支原体精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基和支原体肉汤培养基产品使用说明书配制这3种培养基，高压灭菌，冷却，加灭活小牛血清200 mL和青霉素80万单位，调节pH，加入无菌试管，备用。

1.2.2 病料采集与保存。

选取张家口某鸡场20只疑似感染MS的肉鸡，观察其临床症状。无菌收集疑似感染MS肉鸡鼻孔、气管拭子、肿胀关节液，编号标记，接种于支原体精氨酸肉汤培养基，密封保存。37 ℃下孵育36 h，观察培养基颜色的变化。

1.2.3 菌落的分离培养。

参照顾的乐[5]的MS分离鉴定步骤，无菌抽取少量已经变黄的培养液，确定无杂菌后将可疑培养物在相同的培养基中连续传代7～8代，然后取0.30 mL培养物接种于支原体琼脂培养基，37 ℃厌氧环境下培养12 d，待肉眼可见菌落时挑取单菌落涂片，吉姆萨染色后，置于显微镜10×10倍观察菌落形态，并用灭菌注射器针头挑取典型单菌，接种于培养基中传代培养。

1.2.4 PCR鉴定。

利用“1.2.3”中获取的分离菌株，参照石晓磊等[6]的试验方法，按照血液、细胞、组织基因组总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，并使用第一链反转录试剂盒转换为第一链cDNA作为模板，用16S rRNA基因通用引物 P1（5′-GAAGCAAAATAGTGATATCA-3′）和P2（5′-GTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′）对分离菌的16S rRNA进行PCR扩增。PCR反应体系为RNA模板 0.5 μL，P1和P2各 1 μL，2×Ftaq PCR MasterMix 12.5 μL，用双蒸水补至 25 μL。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，共32个循环;72 ℃延伸 5 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，预期扩增片段为207 bp。

采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物片段。

1.2.5 药敏试验。

1.2.5.1 抗菌药物的稀释。

无菌称取抗菌药物溶于稀释液中，配成浓度10 mg/mL的原液，再用液体培养基将药液稀释至 1 mg/mL，每种药物取0.5 mL，于38 ℃下培养3 d后观察，以确保无真菌或细菌污染。

1.2.5.2 常用抗菌药物最小抑菌浓度的测定。

参照石晓磊[7]的试验方法，对张家口地区分离鉴定的MS进行最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）测定。在灭菌EP管中分别加入支原体肉汤培养基0.4 mL，每种药品1组，每组3个重复，每个重复15个梯度。于每组每个重复第1管加入上述抗生素溶液各0.4 mL，然后按1∶1倍比稀释至第15管后弃去多余溶液，再分别加入40 μL待测菌液。将第16管作为阴性对照（培养基0.4 mL），第17管作为阳性对照（培养基0.4 mL+40 μL待测菌液）。将稀释好的菌液移至96孔细胞培养板上，加盖后置于37 ℃ CO2培养箱中观察7 d。结果判定标准如下：第16管不变色，第17管由原来的无色变为黄色且清澈透明。观察试验孔的颜色变化，记录无MS生长的最大稀释倍数，根据药物稀释浓度计算菌株的最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 临床症状

经观察发现，肉鸡站立困难，跗关节、脚垫肿胀，病鸡俯卧不起。

2.2 菌落特征

显微镜观察发现小面积、光滑、圆形、呈“煎蛋样”的致密菌落（图1）。

2.3 PCR鉴定

PCR扩增产物经凝胶电泳后，可见在207 bp处出现条带（图2）。纯化菌株能扩增出特异性的鸡滑液囊支原体目的片段，扩增片段与预测扩增片段相符。

2.4 药敏试验

药敏试验结果（表1）显示，酒石酸泰乐菌素的最小抑菌浓度（MIC）最高，为0.122 μg/mL;其次为延胡索酸泰妙菌素，为0.244 μg/mL;磷酸替米考星为3.906 μg/mL;盐酸多西环素为7.813 μg/mL;盐酸林可霉素排在第5位，其MIC为15.625 μg/mL;氟苯尼考MIC为31.250 μg/mL，盐酸环丙沙星和硫酸庆大霉素均为62.500 μg/mL;盐酸沙拉沙星最不敏感，其MIC值为125.000 μg/mL。

3 讨论

MS是最重要的肉鸡致病性支原体之一。很多人认为MS感染是一种亚临床呼吸道感染[8]，但越来越多报道表明MS可带来严重的呼吸道感染和关节鸡病，给肉鸡养殖带来严重的經济损失[9-11]。

该研究从张家口某鸡场疑似感染MS的肉鸡鼻孔、气管和跗关节液中成功分离培养出MS菌落，固体培养基上菌落小，圆形，光滑，有致密中央隆起，呈“煎蛋样”。结合养殖场肉鸡的临床症状，鉴定为鸡MS。这说明该鸡场存在MS感染，结果准确可靠，可进一步开展药敏试验，对临床治疗能起到指导作用。

该研究采用的PCR检测方法可快速、灵敏准确地鉴别检测病原体，给临床应用提供了极大的便捷和实用性[12-13]。该研究采用Lauerman等[14]的种特异性引物，通过培养、血清学方面的比较，灵敏度为82%，特异性达100%。通过PCR方法确定该鸡场鸡群MS感染。

在临床治疗中应对治疗菌株进行药敏试验，以选择有效的抗菌药物，防止药物浪费，节约治疗成本，降低环境污染。该试验结果表明，在延胡索酸泰妙菌素等9种抗生素中，鸡MS临床分离株对酒石酸泰勒菌素的MIC为0.122 μg/mL，延胡索酸泰妙菌素MIC为0.244 μg/mL，3株分离株MIC差异不显著，说明酒石酸泰乐菌素与延胡索酸泰妙菌素对该菌株抑制作用明显。盐酸环丙沙星、硫酸庆大霉素的MIC为62.500 μg/mL，盐酸沙拉沙星的MIC为125.000 μg/mL，抑菌效果不佳。该鸡场MS敏感药物为酒石酸泰乐菌素和延胡索酸泰妙菌素，推荐使用这2种药物作为治疗首选药物。

參考文献

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