黑籽南瓜NBS类基因CfRFN2的克隆及VIGS验证

丁玉梅，侯思名，姚春馨，杨加珍，谢俊俊，曾亚文，杨正安*

(1 云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所，昆明 650205；2 云南省农业生物技术重点实验室，昆明650205；3 昆明学院 农学与生命科学学院，昆明 650214；4 云南农业大学 园林园艺学院，昆明650201)

黑籽南瓜(CucurbitaficifoliaBouche.)是葫芦科南瓜属一年或多年生草本藤蔓性植物，是一种具有多种抗性遗传性状的优异种质资源，其对低温、干旱、贫瘠土壤等逆境胁迫有较强的抗性或耐性，对瓜类枯萎病高抗甚至免疫，已作为嫁接砧木有效控制了瓜类枯萎病的发生和危害[1]。枯萎病是由镰孢属尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)寄生引起的一种真菌土传病害，病原菌通过堵塞导管和分泌有毒物质为害寄主，造成叶片萎蔫或全株枯萎死亡[2]，数年来严重影响瓜类栽培的产量和品质，培育抗病品种是实现瓜类枯萎病绿色、高效防控的根本途径，瓜类抗病种质筛选和抗病基因资源的挖掘显得尤为重要。

植物在长期应对各种病原菌胁迫的过程中，进化出可以特异性识别病原菌效应因子的抗性基因(蛋白)。研究发现，尽管病原分泌的效应因子众多，但多数植物抗病基因的结构很保守，根据抗病蛋白的结构特点可以将抗病基因分为5类[3]：富含亮氨酸重复结构的跨膜受体蛋白基因、富含亮氨酸重复结构的蛋白激酶基因、丝氨酸/苏氨酸激酶基因、毒素还原酶基因，以及核苷酸结合位点和富亮氨酸重复(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat，NBS-LRR)抗病蛋白基因。NBS-LRR类基因是植物基因组中含抗病基因数目较大的基因家族，其结构域高度保守。核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)可与ATP或GTP蛋白结合，如ATP合成的β亚基、核糖体延伸因子，参与抗病信号的转导和抗病作用[4-5]，也对抗病蛋白的活性开关起至关重要的作用[6]。富亮氨酸重复结构(leucine-rich repeat，LRR)中的亮氨酸呈规律性重复出现，具有宿主与病原菌的特异性识别特性[7]，LRR结构域也可与N端区域互作，使抗病蛋白保持失活状态[8]。NBS类抗病基因及其抗病分子机制研究一直是研究者关注的热点，最近又从禾本科重要作物中分离鉴定了NBS类抗病基因，如小麦(Triticumaestivum)的抗条锈病TaRGA9等[9]和水稻(Oryzasativa)的抗稻瘟病Pi-kf2(t)基因等[10]。已从葫芦科其他瓜类作物中获得了一些NBS类抗病基因同源序列，如黄瓜[11](Cucumissativus)、中国南瓜[12](Cucurbitamoschata)、西瓜[13](Citrulluslanatus)、甜瓜[14](Cucumismelo)和瓠瓜[15](Lagenariasicerariavar.hispida)，由于瓜类较难进行遗传转化，很少开展基因功能的验证研究。病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是利用带有目的基因的病毒载体侵染植物，随着病毒的复制和转录特异性诱导同源基因mRNA降解或被甲基化修饰，引起表型或生理改变，从而实现基因功能鉴定，近年来已成为模式植物和不适于遗传转化植物的基因功能快速鉴定的工具之一[16]。

前期已在云南黑籽南瓜基因组克隆到一个NBS类抗病基因同源片段HQRGA2 (GenBank ID：MG946756)[17]，通过枯萎病菌胁迫下的RNA-seq结果，鉴定出差异表达的HQRGA2的全长基因CfRFN2(GenBank ID：MK618462)。本研究利用相应克隆载体及生物信息学手段，对黑籽南瓜NBS类基因CfRFN2进行分离克隆，并采用VIGS技术对其功能进行初步验证，研究结果可为黑籽南瓜更多优异基因的克隆和功能验证奠定前期基础，对黑籽南瓜抗病分子机制研究、抗病基因资源的挖掘，以及瓜类作物抗病分子育种具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材 料

以云南黑籽南瓜为材料，种子在10% H2O2中浸泡1 h后，28 ℃恒温箱中催芽，待种子露白后，播种于穴盘中，于植物生长箱中培养(25 ℃，光照16 h/d)。采集真叶功能叶片，用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱用于RNA提取。

VIGS体系共转化载体pTRV1、白化载体pTRV2-PDS和pTRV2的VIGS克隆载体购自武汉天问生物科技公司。pTRV2载体结构见图1。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取及反转录参照天根生化科技有限公司(北京)总RNA提取试剂盒RNApre Pure提取黑籽南瓜叶片总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并按反转录试剂盒(TIANScript Ⅱ RT Kit)合成cDNA模板。

1.2.2CfRFN2基因的克隆在二代RNA-seq获得CfRFN2基因全长序列的基础上，采用Primer 5.0软件设计3对引物(表1)，分3段拼接序列克隆该基因，在QC-R2和QC-F3、QC-R3和QC-F4中引入EcoRⅠ和BglⅡ酶切位点。以cDNA为模板PCR扩增3个片段，扩增体系为：cDNA模板5 μL，10×缓冲液 5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)1 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，KOD聚合酶1 μL(1 U·μL-1)，补ddH2O到50 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。将扩增的片段克隆到pEASY-T1载体中，送华大基因公司进行测序，序列用DNASTAR软件进行全长基因拼接。

图1 pTRV2载体图Fig.1 The map of vector pTRV2

1.2.3CfRFN2核苷酸序列及系统进化树分析将克隆的CfRFN2基因序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上比对验证。使用DNASTAR软件将cDAN翻译为氨基酸序列寻找开放阅读框(ORF)，用Conserved domains detect分析CDS保守结构域，核苷酸相似性分析Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)在线进行。选取14条已知的NBS类抗病蛋白和6条瓜类NBS抗病蛋白序列作为参照序列，用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.2.4CfRFN2组织表达特性分析提取正常生长植株中的根、茎、叶片和果皮中的总RNA，并按反转录试剂盒合成cDNA，每种组织3次重复。以表2中的NBS1F和NBS1R为CfRFN2引物进行qRT-PCR，Actin基因作为内参基因，引物为ActinF和ActinR。qRT-PCR 采用CHamQ qPCR Master Mix试剂盒，反应体系10 μL为：2×缓冲液5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。qRT-PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环。每个反应进行3次重复。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，SPSS 19.0进行统计分析和Excel 2016软件作图，不同组织间采用Duncan新复极差法进行多重比较(P<0.05)。

表1 用于克隆黑籽南瓜CfRFN2基因的扩增引物

表2 黑籽南瓜CfRFN2的VIGS载体构建、测序及验证引物

1.2.5 含CfRFN2基因的VIGS载体构建1)目的片段的扩增 以带有CfRFN2片段3的质粒pEASY-T1-A2-3为模板，引物18OV78-F/R(表2)扩增415 bp的目标片段构建VIGS载体pTRV2-CfRFN2。扩增的PCR反应体系为：DNA模板1 μL，10×缓冲液 5 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，KOD聚合酶 1 μL(1U·μL-1)，加ddH2O到50 μL。PCR反应循环程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 2 min，32个循环，68 ℃延伸5 min。

2) pTRV2-CfRFN2构建和验证 利用pTVR2中的多克隆位点，用SacⅠ与BamHⅠ双酶切目的片段与pTRV2载体，酶切体系为：CfRFN2目的片段或pTRV2 质粒载体30 μL；10×缓冲液 10 μL；SacⅠ2 μL；BamHⅠ2 μL，加ddH2O 56 μL到100 μL，37 ℃孵育 3 h。回收目的片段和载体片段后进行连接，反应体系为：CfRFN2片段7 μL；pTRV2 载体1 μL；10×缓冲液 1 μL；T4DNA 连接酶1 μL。混合后16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，37 ℃过夜培养，挑取白色单菌落到LB/Kan+液体培养基中进行菌液PCR验证(引物18OV82-R和PTRV2-SEQE)，选5个阳性克隆进行测序后提取质粒。

3) 载体转化农杆菌GV3101及验证 将VIGS载体pTRV2-CfRFN2、共转化载体pTRV1、白化载体pTRV2-PDS通过冻融法分别转入到农杆菌感受态GV3101细胞中。挑取转化单菌落到YEB/Kan+和Rif+液体培养基中，菌液PCR检测阳性转化菌株(CfRFN2Q1F/R)。

1.2.6 含VIGS载体的农杆菌侵染黑籽南瓜植株1)农杆菌VIGS菌液的制备 接种前2 d，将含有不同载体(pTRV1、pTRV2-PDS和pTRV2-CfRFN2)的农杆菌接种于LB液体培养基中振荡培养至OD600值为0.8。以1∶50体积转接到含200 mmol·L-1乙酰丁香酮(AS)和 10 mmol·L-1吗啉乙磺酸(MES)的 YEB培养基中，28 ℃过夜培养后离心，菌体重悬于MMA悬浮液(MS+200 mmol·L-1AS+10 mmol·L-1MES+20 g·L-1蔗糖)至OD600值为1.0。

2) 农杆菌侵染黑籽南瓜植株 将pTRV1、pTRV2载体及pTRV2衍生的载体按照1∶1体积比混匀。分为3组接种：空载组pTRV1+pTRV2；白化组：pTRV1+pTRV2-PDS；沉默组：pTRV1+pTRV2-CfRFN2。当黑籽南瓜幼苗长出两叶一心时，用10 μL移液枪头在叶片背面摩擦形成1～2 mm的圆形破损组织，对准破损部位推动不带针头的无菌注射器(1 mL农杆菌菌液)，使叶片表皮下覆盖浸润状菌液。农杆菌侵染后的黑籽南瓜幼苗置于25 ℃光照培养4周，每个组3株，3次重复。

1.2.7 黑籽南瓜植株中TRV病毒检测CTAB法提取黑籽南瓜植株基因组DNA。PCR检测TRV1和TRV2的引物为RNA1F/R和RNA2F/R，检测pTRV2-CfRFN2的引物为CfRFNQ1F/R和CfRFNQ2F/R。

1.2.8 黑籽南瓜植株接种枯萎病菌及病情指数统计以转CfRFN2沉默组植株培养4周后接种枯萎病菌为处理，野生型植株相同条件下培养4周时接种枯萎病菌为正对照，用伤根加灌根法接种枯萎病菌[18]。幼苗病情分级在接种7 d后进行。病情分级参考黄瓜枯萎病病情分级标准[19]。病情指数= [∑(各级病株数×对应各级值)/(调查总株数×发病最高级值)]×100。

1.2.9CfRFN2基因沉默植株的qRT-PCR分析qRT-PCR检测接种枯萎病菌后2 和4 d的CfRFN2基因沉默植株和接种后的野生型植株叶片中的CfRFN2表达量(CfRFNQ1F/R)。

2 结果与分析

2.1 黑籽南瓜CfRFN2基因的克隆及序列分析

设计的3对引物分别从黑籽南瓜cDNA扩增出预期的片段1、片段2和片段3，长度分别为1 341、1 801 和998 bp。将这3片段分别连入克隆载体pEASY-T1，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒后，PCR验证后进行测序。经序列测定正确后，采用DNASTAR软件进行序列拼接，得到CfRFN2基因全长为4 303 bp，ORFfinder预测的ORF为4 092 bp，编码1 363个氨基酸残基，CfRFN2的GenBank登录号为MK618462。对1 363个氨基酸序列进行保守域分析发现，CfRFN2基因含有1个 NB-ARC保守结构域和2个LRR 结构域，属于典型的NBS类基因。用GO(Gene Ontology，GO)数据库对CfRFN2进行注释，该基因注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录体X1的同源基因。

通过在线的亲/疏水性分析(http://cn.expasy.org/cgi-in/protscale.pl)，获得CfRFN2的部分肽链的亲/疏水性分布曲线，发现该基因的部分肽链存在较大范围的亲水区，有较强的亲水性，属于可溶性蛋白。用Signal P-信号肽预测工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)分析该基因的信号肽序列位置可能在19～20个氨基酸之间。

2.2 CfRFN2的核苷酸相似性分析

CfRFN2与其他瓜类抗病基因核苷酸序列进行比对，结果显示核苷相似性在87%～98%之间，其中与美洲南瓜(Cucurbitapepo)的RPS2类(XM_023691176.1)抗病蛋白基因核苷酸相似性最高达98%，得分为7 070 bits；与印度南瓜(Cucurbitamoschata)RPS2类(XM_023141784.1)和中国南瓜(Cucurbitamaxima)RPS2类(XM_023073871.1)的抗病蛋白基因相似性均为97%，得分分别为7 101和7 055 bits；与甜瓜(Cucurbitamelo)At4g27190类(XM_017044036.1)和黄瓜(Cucumissativus)At4g27190类(XM_011650710.1)的抗病基因相似性都为87%，得分分别为4 663和4 615 bits。

2.3 CfRFN2系统进化树分析

将CfRFN2与14条已知物种抗病基因或序列和6条其他瓜类NBS类抗病基因的蛋白序列导入MEGA7.0，共同构建系统进化树。由图2可以看出，这些NBS类抗病蛋白可以分为3大类群。第一大类群包括7条瓜类NBS类抗病蛋白和亚麻抗病蛋白L6；第二大类群包括拟南芥抗病蛋白RPP13和NB-ARC蛋白、小麦L10抗病蛋白、番茄抗病蛋白Hero、水稻NBS-LRR蛋白、Pib蛋白、Nbs4-Pi蛋白；第三大类群包括拟南芥RPS4蛋白和RPP1蛋白、水稻Pita抗病蛋白和Xa1、番茄抗病蛋白Prf、玉米RP1抗病蛋白。值得关注的是，第一大类群中的NBS类抗病蛋白可分为2个分支，7条瓜类NBS类抗病蛋白聚为一个分支，另一个分支为亚麻抗病蛋白L6，说明瓜类NBS类抗病蛋白与亚麻抗病蛋白L6的亲缘关系比与其余2大类群的亲缘关系近，瓜类的7条NBS抗病蛋白亲缘关系较近且进化出现时间较晚。从瓜类的这7条抗病蛋白来看，CfRFN2抗病蛋白与中国南瓜和美洲南瓜抗病蛋白的RPS2、印度南瓜RPS2-like亲缘关系最近，其次是黄瓜的At4g27190和苦瓜的At4g27220，与甜瓜中的抗病蛋白Atg27190亲缘关系相对较远，说明了黑籽南瓜和南瓜属其他瓜类作物之间同属不同种的近缘亲缘关系，同时也表明CfRFN2可能是一个功能性的抗病基因。CfRFN2抗病蛋白进化上出现时间晚于黄瓜和甜瓜的At4g27190以及苦瓜的Atg27220，且更晚于其他物种的NBS类抗病蛋白，说明其进化速度较快，这可能是黑籽南瓜抗性比其他瓜类强的原因之一。

2.4 CfRFN2的组织表达特性分析

CfRFN2基因在黑籽南瓜植株不同组织中的表达量结果(图3)显示，CfRFN2基因主要是在叶片组织中高量表达，其次是茎中，再次是深色果皮组织和根，表达量最低的是浅色果皮组织。

图2 黑籽南瓜CfRFN2基因与其他物种NBS抗病蛋白的进化树Fig.2 Phylogenic tree of the deduced protein of CfRFN2 from C. ficifolia with the known disease resistance proteins

2.5 VIGS载体pTRV2-CfRFN2构建

以带有CfRFN2片段3的质粒pEASY-T1-A2-3为模板对目的片段进行扩增(图4)，扩增片段长度为415 bp。对目的片段进行回收，与酶切后的载体进行连接并转化大肠杆菌，完成沉默载体pTRV2-CfRFN2构建，菌落PCR检测重组子扩增出相应条带。构建完成后转化到农杆菌GV3101用于黑籽南瓜侵染。

2.6 VIGS载体转化黑籽南瓜的体系有效性验证

选取长势良好，叶片无破损的幼苗进行摩擦注射接种，侵染完成后，将植株幼苗于28 ℃、16 h光照、8 h黑暗环境下生长，3周后白化组植株开始出现白化现象，4周后黑籽南瓜植株下部叶片白化明显，但新生叶片白化不明显，而空载组生长正常，说明整个 VIGS 侵染体系对黑籽南瓜有效，但侵染仅发生在前期(图5)。

Y. 叶片; G. 根; J. 茎; P-1. 深色果皮; P-1q. 浅色果皮； 不同小写字母表示不同组织间的差异显著性(P<0.05)图3 CfRFN2基因在黑籽南瓜不同组织中的表达特性Y. Leaf; G. Root; J. Stem; P-1. Dark rind of fruit; P-1q. Light rind of fruit； Different normal letters mean significant differences at 0.05 levelFig.3 Expression characteristics of CFRFN2 gene in different tissues of C. ficifolia

2.7 VIGS载体转化黑籽南瓜植株的PCR检测

以特异引物RNA1F/R和RNA2/R对空载组和白化组植株叶片进行病毒PCR检测，结果(图6和图7)表明，空白组和白化组植株分别扩增出640 和420 bp的目的条带。以特异引物CfRFNQ1F/R和CfRFNQ2F/R对沉默组进行检测结果(图8)显示，转pTRV2-CfRFN2 的沉默组植株中扩增出208 和188 bp的特异性条带。以上结果说明TRV病毒和CfRFN2基因片段成功导入黑籽南瓜。

2.8 转pTRV2-CfRFN2沉默植株抗病性和qRT-PCR分析

以pTRV1和pTRV2-CfRFN2共侵染4周后的黑籽南瓜幼苗接种枯萎病菌为处理，以野生型植株培养4周后接种枯萎病菌为正对照，野生型植株为负对照，接种7 d后植株生长见图9。病情指数分析表明，7 d后CfRFN2 沉默植株较正常对照发病严重，其平均病情指数(37.80)比正对照(28.60)高，为正对照的1.32倍。从病症表现看，CfRFN2 沉默植株多数叶片和叶边缘黄化明显，茎叶轻微下垂，茎部有坏死斑；而正对照植株则茎叶只有轻微黄化，茎部无坏死斑；负对照野生型植株则生长正常。接种枯萎病菌2 d后CfRFN2基因相对表达量比对照下降34.75%，至4 d时表达量下降98.27%，均达到了显著水平(图10)。以上结果初步表明，通过VIGS技术初步验证黑籽南瓜CfRFN2基因具有抗枯萎病的作用。

M. DNA 分子量标准 (100 bp～10 kb)；CK. 阴性对照；1. CfRFN2图4 黑籽南瓜CfRFN2基因片段3中目的片段的扩增M. DNA Marker(100 bp-10 kb); CK. Negative control; 1. CfRFN2Fig.4 PCR amplification of vector-used sequence in CfRFN2 fragment 3 of C. ficifolia

图5 黑籽南瓜被带有pTRV2-PDS和pTRV1农杆菌共侵染后的白化表型Fig.5 Albino phenotype performance of C. ficifolia infected by Agrobacterium carrying vector pTRV2-PDS and pTRV1

1.阴性对照；2. pTRV1质粒；3-6. pTRV1侵染植株图6 pTRV1载体转化黑籽南瓜的PCR验证1. Negative CK; 2. Plasmid of pTRV1; 3-6. Transformed plants by pTRV1Fig.6 PCR verification of pTRV1 vector transformated plants of C. ficifolia

1. pTRV2 vector；2-5. pTRV2-PDS侵染植株；6. 对照图7 pTRV2-PDS载体转化黑子南瓜植株PCR验证1. pTRV2 vector；2-5. Infected plants with pTRV2-PDS；6. CKFig.7 PCR verification of pTRV2 vector transformated plants of C. ficifolia

M.DL2000，1. 引物CfRFNQ1F、CfRFNQ1R检测； 2.引物CfRFNQ2F、CfRFNQ2R检测；CK. 野生型植株图8 沉默载体pTRV2-CfRFN2侵染黑籽 南瓜植株的PCR检测M. DL2000； 1. CfRFNQ1F, CfRFNQ1R； 2. CfRFNQ2F, CfRFNQ2R； CK. Wild typeFig.8 PCR verification of transformed plants of C. ficifolia by silencing vector pTRV2-CfRFN2

*表示与对照相比差异显著(P<0.05) 图10 枯萎病菌接种黑籽南瓜植株(CfRFN2沉默)中的 CfRFN2基因qRT-PCR检测* represents significant difference compared with CK (P<0.05)Fig.10 CfRFN2 expression detection of VIGS plants of C. ficifolia infected by wilt fungi

图9 黑籽南瓜植株的CfRFN2基因通过VIGS沉默后接种枯萎病菌的发病表型Fig.9 The performance of C. ficifolia plants infected by F. oxysorum after CfRFN2 gene silencing via VIGS system

3 讨 论

植物-病原菌互作是一个复杂的生物学过程，在应对病原菌效应因子的入侵方面，植物进化出能特异性识别效应因子的抗病蛋白，激活效应因子触发的免疫响应，导致局部细胞的程序性死亡，引起宿主植物的过敏反应，更为有效地抵抗病原菌的入侵[20]。研究发现多数抗病基因(蛋白)的结构较为保守， 而NBS类基因是目前克隆到的抗病基因中数量最多的基因家族。在典型的NBS类抗病蛋白中，NBS结构域相对保守，而LRR结构域具有多样性[7]。NBS结构域对于维持抗性蛋白的激活或失活状态至关重要，参与抗病信号的传递和触发免疫响应[5-6]。LRR结构域不仅能特异性识别效应因子[7]，也能与N端区域互作，决定抗病蛋白的活性状态，共同监控效应因子[21]。在NBS类抗病基因介导的抗病分子机制中，抗病蛋白主要通过直接作用和间接作用模式来识别效应蛋白，前者如拟南芥的RPP1[22]；间接识别通过效应因子对靶蛋白的攻击或与靶蛋白类似物以及其他抗病蛋白互作激活免疫响应，如拟南芥的抗病基因RPS5[23]和水稻的RGA4/RGA5等[24]。此外，抗病蛋白还与抗病信号传导中的蛋白和病程蛋白发生互作共同调控植物免疫响应[25-26]。本研究中的黑籽南瓜CfRFN2含有1个NBS结构域和2个LRR结构域，LRR结构域数量与黑籽南瓜抗病性强的关系值得关注，但CfRFN2抗病蛋白中的保守结构域和LRR区域的具体功能和识别模式、是否参与抗病信号传导，以及抗病蛋白是否与病程相关蛋白互作等分子机制有待进一步研究。

NBS类基因作为一类免疫监测因子，在植株正常状态下表达量很低或处于失活状态，但其对于病原菌的入侵却高度敏感。研究也表明，多数NBS类基因受病原菌侵染的诱导上调表达，如拟南芥的RPP8[27]、葡萄中的NBS-LRR类基因[28]，青稞中的HvtRGA等[29]。Gutierren等报道鹰嘴豆中的RGA基因早期受枯萎病菌诱导上调表达[30]，我们在黑籽南瓜接种枯萎病菌后的转录组测序比对中，发现Unigene编号为CL7398Contig1恰好是我们关注的NBS类抗病同源片段HQRGA2的全长基因，而该基因在接种后4 d上调表达的DEGs(differential expression genes，DEGs)中，其log2FC值达到了3.99，qRT-PCR分析结果也显示CL7398Contig1在接种后2 和4 d都显著上调表达[31]，说明该基因参与了黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的抗病应答过程。在利用VIGS技术沉默后，CfRFN2基因沉默植株在接种枯萎病菌2 和4 d后均比对照显著下调表达，且病情指数增加，这与蒋鲁亚等报道的小麦中的NBS类基因TaRPM1沉默可以显著降低植株对白粉病的抗病水平的结果类似[32]。组织表达特性分析表明，CfRFN2基因在根中的表达量显著低于叶片和茎部，而枯萎病病原菌从根部浸染植物，我们在前期的室内接种试验中也观察到，用菌液灌根时，黑籽南瓜根尖变黑，产生过敏反应，植株不发病；当采用伤根加灌根法接种时，植株才部分表现病症。我们从黑籽南瓜基因组中挖掘了11个NBS类关键抗病基因，CfRFN2基因是其中之一。综合以上结果，推测CfRFN2蛋白参与调控黑籽南瓜植株的免疫响应，但其对枯萎病侵染的免疫应答机制还有待解析。

本研究用VIGS沉默技术使CfRFN2基因沉默后，黑籽南瓜植株枯萎病发病严重，病情指数比对照增加，VIGS沉默黑籽南瓜植株的基因相对表达量比对照降低，初步验证了黑籽南瓜CfRFN2具有抗枯萎病的功能。有关VIGS沉默技术体系的建立，以往研究表明，病毒载体有宿主依赖性，不同的植物对VIGS沉默效率的影响较大。影响VIGS沉默效果的因素有病毒与宿主植物的相互作用及其生长的环境条件[33]。迄今，应用于葫芦科作物上的病毒载体只见基于苹果潜隐球形病毒(apple latent spherical virus，ALSV)[34]和烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus，TRSV)构建的VIGS载体[35]。本研究采用的是烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)载体，黑籽南瓜植株叶片在接种含有pTRV-PDS载体的农杆菌后，仅有下部的叶片出现白化现象，而在新生叶中白化并不明显。PCR扩增表明，pRNA1和pRNA2已转入黑籽南瓜叶片中，说明TRV病毒系统可以侵染黑籽南瓜，但侵染效率不高。当然，插入片段与目的基因的同源性[36]、环境温度[37]、插入片段的长度[38]、侵染方式[39]和植株的生育期[40]等对沉默效率有较大的影响。本研究利用TRV载体的VIGS技术，qRT-PCR检测表明CfRFN2沉默植株中表达量比对照减低，表现出一定沉默效果，但还需要筛选适于黑籽南瓜高效侵染的病毒和优化VIGS沉默条件，以进行更多基因的VIGS验证。此外，还需在感病瓜类作物上(如黄瓜和西瓜)开展稳定遗传转化研究来进一步验证CfRFN2基因的功能，其是否具有抗其他瓜类病害(如霜霉病)的功能也需进一步探索。本研究中NBS类抗病基因CfRFN2的克隆和VIGS验证为黑籽南瓜更多优异基因的克隆和功能验证奠定了前期基础，也为发掘利用黑籽南瓜优异抗病基因和开展瓜类分子育种提供了新信息。