中国滇芎属花粉形态及叶表皮微形态特征的研究

许新锐，周颂东，何兴金

(四川大学 生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610064)

滇芎属(PhysospermopsisH.Wolff)是伞形科(Apiaceae)芹亚科(Apioideae)美味芹族(Smyrnieae)中的一个较为原始的属，多年生草本植物，全世界约有11个种[1-4]。《Flora of China》记录了8种滇芎属植物，其中4种为中国特有种[5]。然而多数学者[3, 6-7]已经根据形态和分子证据将楔叶滇芎(PhysospermopsiscuneataH.Wolff)从滇芎属划分出去，楔叶滇芎真正的归属还需进一步的研究。该属植物主要分布于喜马拉雅山脉以及横断山脉地区，主要生长于海拔2 250～4 800 m的松林下、高山草甸以及灌丛中[8-12]。滇芎属是芹亚科中一个分类比较困难的类群，种间界限不清晰，与邻近属如瘤果芹属(TrachydiumLindl.)、棱子芹属(PleurospermumHoffm.)以及东俄芹属(TongoloaH.Wolff)的属间界限也存在很多问题。

到目前为止，国内外学者从分子系统学、果实解剖学及微形态学、孢粉学等方面对该属植物进行了部分研究[6-7, 13-20]，但是对滇芎属叶表皮微形态特征研究的报道还未曾有过。在伞形科的形态分类学研究方面，植物叶表皮的形态经常被作为分类依据之一[21-24]。这是由于植物的叶表皮形态较为稳定,气孔器特征、叶片表面纹饰、细胞垂周壁式样等特征具有种间差异，研究这些特征具有一定的分类学意义。另外，花粉形态学研究是伞形科植物分类学研究的重要依据，大量研究表明[25-29]，花粉形态、萌发孔类型和外壁纹饰等特性为伞形科植物的分类提供了许多有价值的信息。席以珍等[19]报道了1种滇芎花粉形态，王萍莉等[20]报道了5种滇芎形态，发现滇芎属的花粉立体形状为三棱球形，赤道面分为菱形、近菱形、近矩形3种形态，极面为3裂圆形或三角形，萌发孔类型、外壁、纹饰在种间无显著差异，反映了该属的自然性。

本研究报道了滇芎属7种植物的花粉形态以及叶表皮微形态，其中3种的花粉形态为首次报道，7种叶表皮微形态为首次报道。本研究通过扫描电子显微镜对滇芎属植物的花粉形态和叶表皮形态进行观察比较，为滇芎属的种间关系与属下系统发育研究提供参考资料。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究的7种滇芎属物种分别为滇芎[Physospermopsisdelavayi(Franchet) H.Wolff]、全叶滇芎[P.alepidioides(H.Wolff & Handel-Mazzetti) R.H.Shan]、木里滇芎(P.muliensisR.H.Shan & S.L.Liou)、丽江滇芎(P.shanianaC.Y.Wu & F.T.Pu)、紫脉滇芎[P.rubrinervis(Franchet) C.Norman]、波棱滇芎[P.obtusiuscula(Wallich ex de Candolle) C.Norman]、小滇芎[P.kingdon-wardii(H.Wolff) C.Norman]，研究材料为干燥后的叶片和花粉，材料来源见表1，凭证标本保存于四川大学标本馆(SZ)，凭证材料保存于四川大学生命科学学院植物系统与分子进化生物学实验室。

表1 材料来源

1.2 方 法

1.2.2 叶表皮扫描电镜观察先将叶片酒精梯度脱水(15%、30%、50%、70%、85%、95%Ⅰ, 95%Ⅱ, 100%Ⅰ, 100%Ⅱ, 每个梯度时间间隔1 min左右)，然后避开明显的叶脉，剪取叶片近轴面(上表皮)和远轴面(下表皮)中部的材料，将其粘在导电胶上，喷金镀膜后，置于JSM-7500F型扫描电镜下观察后拍照保存并分析。叶表皮描述的术语参照Baranova[33]和Wilkinson[34]的描述。数据测量工作用软件KaryoType[30]完成，在远轴面随机选取10个气孔来测量气孔的大小，取均值作为各物种气孔的平均大小。

2 结果与分析

2.1 滇芎属花粉形态特征

本研究报道的滇芎属植物中，花粉形态分为3种类型，即菱形类型、椭圆形类型和近矩形类型。(1)滇芎、全叶滇芎、丽江滇芎和波棱滇芎的花粉属于菱形类型，其花粉粒的赤道面观均为菱形，赤道中心位置向外突出。滇芎的极面观为三角形，全叶滇芎、丽江滇芎和波棱滇芎的极面观则均为三角圆形。极轴长19.57～23.19 μm，赤道轴长13.99～17.42 μm，极轴与赤道轴之比P/E为1.22～1.48。(2)紫脉滇芎和小滇芎为椭圆形类型。它们的赤道面观均为椭圆形，赤道中心位置稍向外突出。紫脉滇芎的极面观为三角形，小滇芎的极面观为钝三角形。(3)木里滇芎为近矩形类型。其赤道面为近矩形，赤道两侧近乎平直，极面观为钝三角形。

2.2 滇芎属叶表皮微形态特征

观察近轴面的微形态可以发现，滇芎属植物叶片上表皮的细胞轮廓大都不清晰(图版Ⅱ，A1、B1、D1、E1、F1、G1)，只有木里滇芎的叶片上表皮细胞为规则的多边形(图版Ⅱ，C1)。大部分滇芎属植物的角质膜纹饰为不规则的条纹(图版Ⅱ，A1、D1、E1、F1、G1)，滇芎和波棱滇芎还有明显的脊状突起，紫脉滇芎和小滇芎具有不太突出的脊状突起；而全叶滇芎和木里滇芎的角质膜接近光滑，其中也存在少量的条纹，且全叶滇芎的叶片上表皮也可以看到一些不太明显的脊状突起(图版Ⅱ，B1、C1)。

观察远轴面的微形态可以发现，除了木里滇芎的叶片上表皮细胞为规则的多边形(图版Ⅱ，C2)，滇芎属其他植物叶片上表皮的细胞轮廓还是大都不清晰(图版Ⅱ，A2、B2、D2、E2、F2、G2)。滇芎、丽江滇芎、紫脉滇芎、小滇芎的角质膜纹饰为密集的条纹(图版Ⅱ，A2、D2、E2、G2)，全叶滇芎的较致密具少量条纹及颗粒(图版Ⅱ，B2)，木里滇芎和波棱滇芎的角质膜接近光滑，且在气孔器周围有少量条纹(图版Ⅱ，C2、F2)。

观察发现，远轴面的气孔数量及密度均大于近轴面。我们对气孔的观察和统计均来自远轴面。滇芎属植物的气孔器的形状均为椭圆形及卵圆形。其中，滇芎、丽江滇芎和小滇芎的气孔形状为椭圆形(图版Ⅱ，A3、D3、G3)，其长宽比L/W为1.6～2.0，全叶滇芎、木里滇芎、紫脉滇芎和波棱滇芎的气孔形状为卵圆形(图版Ⅱ，B3、C3、E3、F3)，其长宽比L/W为1.3～1.6。滇芎属植物气孔器的长为14.90～25.40 μm，宽为9.76～17.49 μm，其中全叶滇芎的气孔器最大，木里滇芎的气孔器最小。滇芎属植物气孔器的内缘为波状、浅波状、啮蚀状，气孔器的外拱盖形态为隆起或较扁平。在扫描电镜下7种滇芎属植物叶表皮的微形态特征详见表3。

表2 滇芎属7种植物花粉形态特征

表3 滇芎属7种植物叶表皮微形态特征

3 讨 论

3.1 花粉形态在滇芎属中的分类意义

伞形科的分类主要把果实的形态作为其分类依据，属间及属下物种分类困难，因此需要更多的形态特征来作为其分类依据。前人的研究发现花粉的形态特征为伞形科的分类提供了重要信息。滇芎属的属下种间界限一直以来都存在问题，因此增加花粉形态作为其分类依据有助于厘清滇芎属下的种间关系以及系统发育关系。

本研究发现，滇芎、全叶滇芎、丽江滇芎、波棱滇芎的花粉形态相似，赤道面观均为菱形，极轴与赤道轴之比P/E分别为1.28、1.22、1.45和1.48，均小于1.5。极面观为三角形或三角圆形，萌发孔为角孔，赤道区外壁纹饰皆为典型的脑状纹饰，其中丽江滇芎的赤道区外壁纹饰为片状脑纹，其余3种皆为短棒状脑纹。这些特征表明上述4种滇芎属植物均属于菱形花粉，此类型花粉为伞形科中最为原始的花粉类型。这表明滇芎、全叶滇芎、丽江滇芎和波棱滇芎在滇芎属中处于较原始的地位。

紫脉滇芎和小滇芎的赤道面观为椭圆形，极轴与赤道轴之比P/E分别为1.69和1.74，均大于1.5，小于2.0。紫脉滇芎的极面观为三角形，小滇芎的极面观为钝三角形，角孔，赤道区外壁纹饰皆为短棒状脑纹。这2种花粉属于椭圆形花粉类型，是一种过渡花粉类型，比菱形花粉进化。这表明紫脉滇芎和小滇芎是滇芎属内较为进化的种，可能是由滇芎属内的原始物种逐渐分化而来的。

木里滇芎的赤道面观为近矩形，极轴与赤道轴之比P/E为2.07，大于2.0。极面观为钝三角形，角孔，赤道区外壁纹饰为短棒状脑纹。这种花粉属于近矩形花粉类型，是伞形科里一种比较进化的花粉类型。这表明木里滇芎为滇芎属内最为进化的物种。

滇芎属内物种的演化趋势是从滇芎、全叶滇芎、丽江滇芎、波棱滇芎等较原始的种，逐渐分化为紫脉滇芎和小滇芎等较为进化的种，最后发展成木里滇芎等最为进化的种类。这与王萍莉等[23]的研究存在冲突，对滇芎和木里滇芎的研究结果不一致，但是分子证据[35]支持本研究结果。滇芎属的花粉在萌发孔类型，外壁纹饰上均无显著的种间差异，这表明花粉形态并没有发生急剧的演化，这可能是因为分歧时间较短，或者是花粉形态对于环境选择压力较为稳定。

波棱滇芎和小滇芎在外形上极为相似，在野外仅根据有无主茎来将它们区分开来。且它们的分布地存在重叠，波棱滇芎在中国主要分布在云南的德钦，西藏的亚东、聂拉木等地；小滇芎主要分布在西藏的聂拉木，波棱滇芎的分布范围更广。由于它们在形态上的相似性，Pimenov[3]认为波棱滇芎和小滇芎是一个物种。从花粉形态来看，波棱滇芎是较为原始的菱形花粉，而小滇芎是比较进化的椭圆形花粉，可以看出小滇芎的花粉是比波棱滇芎的花粉更为进化的，可以根据花粉特征将两个种区分开来，但是在赤道面纹饰和萌发孔的类型上，这两个物种存在一定的一致性。

3.2 叶表皮微形态在滇芎属中的分类意义

对滇芎属7种植物的叶表皮微形态的观察结果表明：滇芎属植物的叶表皮大都没有明显的细胞轮廓，只有木里滇芎可见多边形的细胞轮廓。角质膜纹饰都具有明显或不明显的条纹。故滇芎属植物在细胞形状和角质膜纹饰都不具显著的差异，表现出一定的稳定性。在气孔的分布、气孔形状、气孔的内缘形态以及外拱盖形态上出现了一定的种间差异。滇芎、丽江滇芎、紫脉滇芎和波棱滇芎的气孔只在远轴面有分布，全叶滇芎、木里滇芎和小滇芎的气孔在近轴面和远轴面皆有分布，其中，木里滇芎的气孔在近轴面分布的密集程度要大于全叶滇芎和小滇芎；气孔形状为椭圆形的有滇芎、丽江滇芎和小滇芎，气孔形状为卵圆形的有全叶滇芎、木里滇芎、紫脉滇芎和波棱滇芎；滇芎、木里滇芎、小滇芎的气孔内缘为浅波状，全叶滇芎、丽江滇芎和波棱滇芎的气孔内缘为波状，而紫脉滇芎的气孔内缘为啮蚀状；紫脉滇芎、波棱滇芎及小滇芎气孔的外拱盖为较扁平的，其余4种滇芎植物气孔的外拱盖均隆起。滇芎属植物的每个种都有其特定的叶表皮微形态特征，所以叶表皮微形态特征也可以作为一项重要的分类依据，帮助解决滇芎属的种间亲缘关系问题。根据7种滇芎属植物的叶表皮微形态特征，编制分类检索表如下。

对于波棱滇芎和小滇芎的亲缘关系问题，从叶表皮微形态来看，波棱滇芎与小滇芎均不具清晰的细胞轮廓，近轴面的角质膜纹饰均为条纹纹饰，但是波棱滇芎远轴面的角质膜接近光滑，而小滇芎远轴面的角质膜纹饰依然为密集的条纹纹饰。波棱滇芎的气孔形状为卵圆形，小滇芎的气孔形状为椭圆形，二者气孔的外拱盖均为较扁平的类型，内缘为波状或浅波状。上述叶表皮微形态特征在波棱滇芎和小滇芎之间展现出一定的变化，然而在某些特征上也存在一定的相似性，所以本研究结果不支持Pimenov[3]把这两个种合并为一个种的处理，但是这两个种的亲缘关系应该比较近。分子研究[35]也表明，这两个物种完全分开了，且在滇芎属中的亲缘关系最近，是姐妹类群。

本研究结果表明，花粉形态和叶表皮微形态特征对于滇芎属的分类具有一定的参考价值，可以帮助解决依靠宏观形态难以解决的种间分类问题。然而，从Pimenov[3]的研究看来，中国滇芎属的种类还不只有《Flora of China》上面记载的8种，更多的种类还需要进一步的研究，该属更大范围的花粉形态以及叶表皮微形态还有待研究。

图版Ⅰ电镜下滇芎属植物花粉形态
A. 滇芎；B. 全叶滇芎；C. 木里滇芎；D. 丽江滇芎；E. 紫脉滇芎；F. 波棱滇芎；G. 小滇芎；1. 极面观；2. 赤道面观；3. 赤道面纹饰
PlateⅠ Pollen morphology ofPhysospermopsisH.Wolff under SEM
A.P.delavayi; B.P.alepidioides; C.P.muliensis; D.P.shaniana; E.P.rubrinervis; F.P.obtusiuscula; G.P.kingdon-wardii; 1. Polar view; 2. Equatorial view; 3. Equatorial sculpture

图版Ⅱ电镜下滇芎属植物叶表皮微形态
A.滇芎；B.全叶滇芎；C.木里滇芎；D.丽江滇芎；E. 紫脉滇芎；F. 波棱滇芎；G. 小滇芎；1. 近轴面；2. 远轴面；3. 气孔
PlateⅡ Leaf epidermal micro-morphology ofPhysospermopsisH.Wolff under SEM
A.P.delavayi; B.P.alepidioides; C.P.muliensis; D.P.shaniana; E.P.rubrinervis; F.P.obtusiuscula; G.P.kingdon-wardii; 1. Adaxial epidermis; 2. Abaxial epidermis; 3. Stoma